文章標題：Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution研究背景
陰莖勃起是一個(gè)復雜的生物學(xué)過(guò)程，整個(gè)過(guò)程需要神經(jīng)、內分泌、血管和陰莖海綿體組織精密調節、協(xié)調完成。海綿體損傷可引起多種疾病，包括影響了5%~22%男性的陰莖勃起功能障礙（ED）。
ED不僅影響患者身心健康以及家庭和諧，還可能是心血管疾病的先兆。雖然目前已經(jīng)知道在勃起發(fā)生和維持中不同功能區域的作用，但以往研究大多都依賴(lài)于解剖觀(guān)察、影像學(xué)檢查，以及少數基因或蛋白質(zhì)的表達模式分析，缺乏全面的分子水平分析。
此外，多數ED相關(guān)研究是基于大鼠模型的，但當前對于大鼠和人類(lèi)間陰莖海綿體（CC）的解剖學(xué)和信號網(wǎng)絡(luò )差異認識尚不清晰。因此，為了更好的使用大鼠模型開(kāi)展研究，有必要深入研究大鼠陰莖海綿體的結構/功能調控與人類(lèi)的異同。
材料方法
研究材料：4例陰莖癌患者，3例健康志愿者，10例DMED（糖尿病性勃起功能障礙）患者；4只健康大鼠，6只DMED大鼠模型。
研究方法：Masson/H&E染色（n=7），scRNA-seq（n=12，3例健康人類(lèi)CC/3例DMED人類(lèi)CC，3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC），空間轉錄組技術(shù)（BMKS1000，n=3，1例陰莖腫瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠）等。
驗證實(shí)驗：包括油紅O/尼羅紅/菲律賓鏈霉菌染色、不同硬度ECM條件下培養的FB細胞形態(tài)信息及bulk RNA-seq數據、免疫熒光、超聲彈性成像。
研究結果
1.人類(lèi)和大鼠CC細胞和空間特征
通過(guò)scRNA-seq數據，研究者在人類(lèi)CC（陰莖海綿體）中鑒定出7種類(lèi)型細胞，僅在大鼠CC中發(fā)現一小部分中性粒細胞和B細胞。使用scRNA-seq數據對空間轉錄組數據進(jìn)行注釋?zhuān)–ellTrek），研究者得到了人類(lèi)和大鼠CC樣本空間細胞分布圖譜（level3，20μm分辨度），發(fā)現雖然人類(lèi)和大鼠CC中的細胞類(lèi)型相似，但每種類(lèi)型細胞比例、空間分布特征存在異質(zhì)性。
圖1-通過(guò)scRNA-seq和空間轉錄組技術(shù)得到的人類(lèi)，以及正常/DMED條件下大鼠的CC細胞全局表達譜
2.人類(lèi)和大鼠CC組織中的空間異質(zhì)性
作為一種特殊的血管竇結構，當前已初步認識到CC上不同區域的類(lèi)型不同。得益于空間轉錄組技術(shù)，研究者發(fā)現人類(lèi)CC組織中SVG（空間差異基因）top（如CCL18、PLA2G2A、C3）主要在不同類(lèi)型細胞中表達，但有一些表現出空間分布特異性的基因并沒(méi)有在scRNA-seq數據中表現出細胞類(lèi)型特異性；人類(lèi)CC組織3個(gè)代表性區域中，不同區域的細胞比例不同，如區域I（海綿體動(dòng)脈區域）EC（內皮細胞）占比更高，而區域III（白膜附近區域）包含更少的FB（成纖維細胞）但SMC（平滑肌細胞）豐富。大鼠CC組織也表現出相似的情況（大鼠CC中缺乏梳狀中隔和明顯的海綿體動(dòng)脈，研究者根據人類(lèi)CC代表性區域的空間位置，在大鼠CC中也劃分出可比較的3個(gè)代表性區域）。
圖2-人類(lèi)CC組織的轉錄特征和空間異質(zhì)性
3.根據scRNA-seq數據比較人類(lèi)和大鼠CC中的細胞類(lèi)型
多數勃起調控研究是基于大鼠模型的。為了理解大鼠和人類(lèi)間CC微環(huán)境的異同，研究者通過(guò)分析scRNA-seq數據中的人—大鼠同源基因，發(fā)現雖然人類(lèi)和大鼠物種不同，但CC中相同類(lèi)型細胞仍可以聚成同一簇，進(jìn)一步分析發(fā)現人類(lèi)和大鼠CC中相同類(lèi)型細胞的轉錄相似性>70%且正相關(guān)，表明在多數情況下，使用大鼠模型模擬、研究人類(lèi)CC微環(huán)境的轉錄調控是可接受的。然而，人類(lèi)和大鼠CC中相同類(lèi)型細胞的DEGs（差異表達基因）top并不一致，提示當研究者更關(guān)注一個(gè)或幾個(gè)基因或通路時(shí)，使用大鼠模型要特別注意。
附錄圖7-scRNA-seq數據評估得到的大鼠和人類(lèi)CC間相似性和差異性
4.比較人類(lèi)和大鼠CC空間轉錄組全局
通過(guò)分析空間轉錄組數據中的人—鼠同源基因，研究者找到人類(lèi)和大鼠共有的459個(gè)top SVG，大多數SVG并不是細胞類(lèi)型特異的，其中EC、FB和SMC是表達這些SVG最多的3種類(lèi)型細胞。富集分析結果顯示，基礎生物學(xué)過(guò)程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”，在人類(lèi)和大鼠CC組織的空間轉錄組數據中是保守的；人類(lèi)特異SVG主要與炎癥響應有關(guān)，而這些SVG的大鼠同源基因主要與代謝過(guò)程有關(guān)。
圖3-比較大鼠和人類(lèi)CC微環(huán)境中的空間差異基因和信號通路
5.人類(lèi)和大鼠CC微環(huán)境中的細胞—細胞互作分析
為了研究、比較人類(lèi)和大鼠間CC微環(huán)境的復雜信號網(wǎng)絡(luò )，研究者使用scRNA-seq數據進(jìn)行CellChat分析，發(fā)現大鼠CC中的細胞互作數量雖然小于人類(lèi)，但細胞互作強度是相似的?；谶@些互作的表達模式，研究者進(jìn)行簡(jiǎn)單的分類(lèi)，發(fā)現雖然胞外基質(zhì)相關(guān)的互作整體強度與細胞類(lèi)型間配體-受體強度相當，但兩者基因組成是有差異的；血管生成相關(guān)的互作整體強度在人類(lèi)和大鼠中沒(méi)有差異，但基因組成存在差異，如大鼠CC微環(huán)境中是主要是VEGFB表達，而人類(lèi)CC微環(huán)境中高表達的是VEGFA和IGF1。
空間轉錄組數據顯示，VEGF配體主要集中富集在人類(lèi)CC中的海綿體動(dòng)脈（區域I）附近，而在蛋白質(zhì)水平，VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空間分布模式與人類(lèi)的相似，但蛋白質(zhì)水平上區域I中存在高濃度的VEGFA和IGF1。此外，免疫相關(guān)的互作在人類(lèi)CC與大鼠CC中表現出相似或者更高的整體信息流，但一些配體亞型在大鼠中高表達。
這些scRNA-seq數據的分析結果與基于空間轉錄組數據SVG的富集分析結果高度一致。
圖4-配體-受體對分析顯示人類(lèi)和大鼠CC組織中的細胞—細胞通訊
6.EC表現出顯著(zhù)的空間異質(zhì)性和物種差異
根據以往的解剖觀(guān)察以及scRNA-seq數據分析，可知CC中包含3種類(lèi)型EC（內皮細胞），包括GJA5+ EC（動(dòng)脈內皮細胞）、SELP+ EC（靜脈內皮細胞）以及KIT+ EC（海綿體竇內皮細胞）。人類(lèi)CC中GJA5+ EC占比最低，主要分布在海綿體動(dòng)脈區域；SELP+ EC主要分布在白膜區域；KIT+ EC廣泛分布。但大鼠CC中，Selp+ EC比例更高，Gja5和Kit可能并不是有用的靜脈和CC內皮細胞標志物?；趕cRNA-seq數據進(jìn)行GO分析，研究者發(fā)現不同類(lèi)型EC富集了不同功能，多數細胞類(lèi)型特異性的term（條目）在人類(lèi)CC中并沒(méi)有空間分布異質(zhì)性，但一些特殊term在大鼠CC中表現出空間分布異質(zhì)性。
附錄圖10-人類(lèi)和大鼠EC簇間的物種相似性和異質(zhì)性
7.SMC表現出顯著(zhù)的空間異質(zhì)性和物種差異
根據以往研究結果，研究者將CC中的SMC（平滑肌細胞）簇分為VSMC（血管平滑肌細胞）和CCSMC（海綿體小梁平滑肌細胞）。數據分析結果顯示，兩種類(lèi)型SMC在物種間存在顯著(zhù)差異，其中人類(lèi)CCSMC高表達DES，VSMC高表達RGS5；大鼠CCMS和VSMC可通過(guò)Igfbp2和Rgs5區分；蛋白質(zhì)水平上，CCSMC與VSMC不同，后者不表達肌動(dòng)蛋白或肌球蛋白；根據SMC的SVG空間分布模式，發(fā)現ACTC1/Actc1只在人類(lèi)CCSMC中表達；前期研究發(fā)現ADRA2A在人VSMC表達，ADRA2C在人CCSMC中表達，空間轉錄組數據也驗證了這一發(fā)現，但大鼠CC中Adra2a并沒(méi)有表現出細胞類(lèi)型特異性而Adra2c的表達未檢測到，提示在這個(gè)方面大鼠并不是合適的研究模型。
圖5-人類(lèi)和大鼠SMC簇間的物種相似性和異質(zhì)性
8.人類(lèi)和大鼠FB有相似的聚類(lèi)特征和空間分布，但亞型比例不同
近期，CC的FB（成纖維細胞）成為研究熱點(diǎn)，但對其空間和物種異質(zhì)性仍不清楚。研究者根據PI16、APOE及其他載脂蛋白、COMP的表達情況，將人類(lèi)CC FB分成3種亞群?？臻g轉錄組數據分析結果顯示，人類(lèi)CC中3種FB亞群空間分布模式不同，富集的功能也不同；大鼠CC FB表現出與人類(lèi)CC FB相似的亞群和標志基因，但每種亞群的比例與人類(lèi)顯著(zhù)不同。
APOE與脂滴轉運密切相關(guān)。油紅O染色顯示大鼠CC中脂滴位置與Apo+ FB的空間分布高度一致，且都在白膜下富集；免疫熒光染色結果顯示大多數脂滴與APOE蛋白共區域化出現且在白膜下有更高的富集，特別是在區域III（左右CC連接區域）；人類(lèi)CC中APOE分布特征與大鼠類(lèi)似但表達更廣泛。
前期研究成果顯示，FB是人類(lèi)CC中最強的外向信號源，在調控微環(huán)境穩態(tài)中起到重要作用。因而，FB表型轉變可能與CC結構和功能變化密切相關(guān)。通路活性分析顯示PI3K通路活性分值與APO+ FB有相似的空間分布模式，而TNF-α和TGF-β的空間分布模式與之相反；空間上CCSMC與FB相距較遠（level13，100μm分辨度分析FB生態(tài)位），而GJA5+ EC、VSMC、SWC（Schwann細胞）和T細胞與COMP+ FB空間距離較近，表明COMP+ FB與神經(jīng)和血管密切相關(guān)；CXCLs、CCN2以及C3與3種FB亞群生態(tài)位正相關(guān)，但CCN5和C7與COMP+ FB生態(tài)位負相關(guān)，GREM1不與PI16+ FB或APO+ FB相關(guān)但與COMP+ FB生態(tài)位顯著(zhù)正相關(guān)。
圖6-CC中不同成纖維細胞亞群表現出不同的空間分布特征
9.CC中機械力信號存在空間異質(zhì)性，并調控FB表型轉變
以往研究表明病理條件下YAP信號誘導FB-肌成纖維細胞表型轉變，但這不能完全解釋生理條件下存在著(zhù)的多種FB亞型，特別是有高脂質(zhì)代謝活性的APO+ FB。有報道ECM（胞外基質(zhì)）機械力調控多種細胞類(lèi)型的脂質(zhì)代謝。
本研究中，研究者發(fā)現COMP+ FB生態(tài)位顯著(zhù)富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term；人和大鼠CC中ECM/細胞組成比例表現出明顯的空間異質(zhì)性；空間轉錄組數據和免疫熒光染色結果類(lèi)似，靠近陰莖背神經(jīng)血管束的上極區域顯示出較低的纖維化水平，而遠離背神經(jīng)血管束的顯示出較高的纖維化水平；空間轉錄組數據和超聲彈性成像結果都表明，APO+ FB與更柔軟的組織硬度有關(guān)，而COMP+ FB與更硬的組織有關(guān)；不同胞外基質(zhì)硬度培養下的CC FB形態(tài)不同，bulk RNA-seq數據顯示機械應激顯著(zhù)改變了FB的轉錄狀態(tài)，一些參與調控脂質(zhì)代謝的基因與低機械力信號有關(guān)；scRNA-seq數據分析結果顯示APO+ FB分值隨組織硬度增加而降低，COMP+ FB分值隨組織硬度增加而增加；染色結果顯示隨著(zhù)組織硬度增加，FB中的中性脂質(zhì)和膽固醇累積降低。
綜上，這些結果表明機械力信號直接參與調控FB的表型轉變。
圖7-局部機械力信號強度決定了這個(gè)區域內成纖維細胞的表型
10.人類(lèi)和大鼠CC經(jīng)歷了相似的DMED病理變化
為了更好的認識DMED病理條件下，人類(lèi)和大鼠CC微環(huán)境發(fā)生的變化是否與每種CC細胞類(lèi)型中發(fā)生的分子水平變化相一致，研究者通過(guò)分析scRNA-seq數據，發(fā)現DMED大鼠模型和DMED患者都經(jīng)歷了顯著(zhù)的纖維化以及細胞組分丟失，但兩者間的轉錄組差異顯著(zhù)。富集分析結果顯示，僅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”；“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”僅在人類(lèi)DMED患者SMC中發(fā)現，“regulation of MARK cascade”僅在DMED大鼠模型SMC中富集；“rhythmic process”僅在人類(lèi)DMED患者FB中富集，“l(fā)eukocyte activation”僅在DMED大鼠模型FB中富集。
空間轉錄組數據顯示DMED大鼠模型陰莖中，除尿道以外的組織區域轉錄表達水平整體降低，而scRNA-seq數據顯示DMED狀態(tài)細胞的轉錄水平高于正常狀態(tài)的細胞，這或許意味著(zhù)，可能是由于單位面積上細胞數量降低，導致空間轉錄組數據出現轉錄水平降低的現象。
附錄圖13-通過(guò)scRNA-seq和空間轉錄組評估DMED條件下CC的病理變化
研究總結
本文繪制了人類(lèi)和大鼠陰莖海綿體（CC）的生理、病理條件下的空間轉錄組圖譜，結合多組學(xué)數據，系統比較了兩個(gè)物種間的異同。本研究成果為人類(lèi)、大鼠陰莖海綿體的分子解剖學(xué)，以及跨細胞類(lèi)型和區域的信號網(wǎng)絡(luò )提供了清晰洞見(jiàn)。同時(shí)在分子水平比較了人類(lèi)和大鼠的陰莖海綿體異同，為理解動(dòng)物模型的可用性提供基礎數據，推動(dòng)臨床前實(shí)驗和臨床轉化更高效、可靠。文中還闡述了CC中機械力信號的空間分布異質(zhì)性，并確認ECM機械信號可以調節FB表型轉變，提出靶向APO+ FB或可成為未來(lái)治療DMED的有效手段。最后，研究者也明確指出了本文中研究的局限性，為后續研究指明了方向。
參考文獻：
Yin et al, Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution. Cell Rep. 2024 Sep 24;43(9):114760. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114760. Epub 2024 Sep 18.
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