百邁客單細胞測序
單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）是在單細胞水平進(jìn)行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個(gè)細胞的表達譜，避免單個(gè)細胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細胞的均質(zhì)化覆蓋。
導讀
用人多能干細胞（hPSC）形成種間嵌合體已成為在體內評估hPSC多能性的有效方案，并且可能在再生醫學(xué)，包括移植器官和組織再生中發(fā)揮重要作用。使用小鼠和豬胚胎的研究表明，hPSCs并不能有力地促進(jìn)與人類(lèi)進(jìn)化距離較遠的物種的嵌合體形成。本研究主要是在體外培養的食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎中研究人擴展多能干細胞（hEPSC）的嵌合能力，證明hEPSCs能夠在食蟹猴胚胎中存活、增殖，并繪制植入前后細胞圖譜。同時(shí)還發(fā)現了種間細胞相互作用，這些事件可能有助于塑造嵌合胚胎內人類(lèi)和食蟹猴細胞的獨特發(fā)育軌跡。本研究結果可能有助于更好地了解早期人類(lèi)胚胎發(fā)育和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)化，并制定策略以改善進(jìn)化距離較遠的物種的人類(lèi)嵌合體的形成。
實(shí)驗方法
材料：注入tdTomato+ hEPS細胞的食蟹猴早期囊胚
方法：?jiǎn)渭毎D錄組測序
研究結果
1、體外人猴嵌合囊胚的形成
為確定非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中hPSC的嵌合能力，本研究使用了通過(guò)細胞重編程產(chǎn)生的特征明確的hEPSC系iPS1-EPSC，它在小鼠胚胎第10.5天（E10.5）表現出優(yōu)于其他hPSC的嵌合性。與之前的報告一致，iPS1-EPSCs表現出圓頂形集落形態(tài)，并表達核心多能性轉錄因子OCT4、NANOG和SOX2（圖 S1A）。為了生成人猴嵌合胚胎，對食蟹猴的早期囊胚（受精后 6 天 [d.p.f.6]）注射了25個(gè)用tdTomato（TD）標記的iPS1-EPSC，注射的胚胎培養到晚期囊胚階段（d.p.f.7）進(jìn)行分析，發(fā)現食蟹猴囊胚內hEPSC的增殖很明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，在所有d.p.f.7的食蟹猴囊胚中檢測到TD+ iPS1-EPSCs（100%，n = 132）（圖 S1B）。
圖S1 宿主食蟹猴胚胎中hEPSCs的譜系規范
2、人猴嵌合胚胎的轉錄圖譜
為進(jìn)一步描繪人猴嵌合胚胎的發(fā)育軌跡，進(jìn)行了scRNA-seq以分析不同發(fā)育階段的人和猴細胞的轉錄組。胚胎分離后，使用熒光顯微鏡手動(dòng)收集單個(gè)人類(lèi)（TD+）和猴（TD-）細胞并進(jìn)行scRNA-seq。對離體培養過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)從嵌合胚胎中分離的227個(gè)人的和302個(gè)食蟹猴的細胞進(jìn)行了測序（d.p.f.9-d.p.f.17）。TD表達和比對到人類(lèi)或食蟹猴基因組的reads用于進(jìn)一步確認每個(gè)細胞的來(lái)源物種（圖 S2A 和 S2B）。嚴格過(guò)濾后，200 個(gè)人的和 272 個(gè)食蟹猴的細胞用于進(jìn)一步分析。每個(gè)細胞平均檢測到 9,798 個(gè)基因（每百萬(wàn)轉錄本【TPM】>0）和27,936,953條reads，在人和猴細胞之間檢測到的基因數量和reads沒(méi)有統計學(xué)差異（圖 S2C）。為進(jìn)行比較，本分析中還選擇了已發(fā)表的食蟹猴和人類(lèi)胚胎細胞的scRNA-seq數據集。為避免不同數據集的批次影響，本研究使用“錨定”方法去除批次效應（圖 S2C）。
圖S2 細胞物種來(lái)源鑒定和QC
對scRNA-seq數據進(jìn)行了t-SNE分析，確定了所有樣本（嵌合胚胎和對照胚胎）中存在4個(gè)主要細胞cluster：EPI、HYP、TE和EXMC（圖 1A、1B和S2D）。通過(guò)細胞特異性marker分析，發(fā)現人和食蟹猴之間存在保守性（圖 S2E）。嵌合胚胎中這些細胞類(lèi)型的存在表明宿主胚胎的發(fā)育基本上不受注射的hEPSCs的影響。系統發(fā)育樹(shù)分析（基于基因表達水平）顯示，雖然嵌合胚胎中的大多數食蟹猴細胞分離成不同的細胞類(lèi)型特異性簇（EPI、HYP和TE），但嵌合人類(lèi)HYP-和TE-like 細胞與 EPI-like 細胞聚集在一起（圖 1C）。因此，嵌合食蟹猴細胞比引入的hEPSC表現出更強的譜系分離。與IF結果一致，在scRNA-seq數據（圖 1A 和 1D）中鑒定到的人類(lèi)TE-like細胞很少，因此被排除在后續分析之外。這些結果表明，hEPSCs在被引入食蟹猴早期囊胚并進(jìn)行離體胚胎培養后，可以分化為幾種植入前和植入后早期細胞類(lèi)型。
圖1 人猴嵌合胚胎的單細胞轉錄圖譜
3、hEPSCs在人猴嵌合體發(fā)育過(guò)程中的轉錄組動(dòng)力學(xué)
首先基于所有細胞的轉錄組學(xué)特性構建了一個(gè)導向圖（SPRING），所有細胞分為三個(gè)分支：EPI、HYP和TE（圖 2A），明確了嵌合體和對照（人和食蟹猴）胚胎之間基因表達模式的相關(guān)性（圖 2B）。當嵌合人類(lèi)細胞與對照人類(lèi)（0.460）或對照食蟹猴（0.459）細胞進(jìn)行比較時(shí)，獲得了類(lèi)似的相關(guān)系數（圖 2B，右圖），但與對照胚胎相比，嵌合猴細胞的相關(guān)系數高于嵌合人類(lèi)細胞（圖 2B，左圖）；接下來(lái)發(fā)現嵌合人EPI-like細胞與人胚胎中的EPI細胞相似，而嵌合人HYP和EXMC-like細胞分別與嵌合猴HYP和EXMCs細胞相關(guān)系數最高（圖 2C）。同時(shí)發(fā)現嵌合人類(lèi)EPI-like細胞逐漸傾向于嵌合猴EPI細胞，R2值從0.363（植入前EPI [Pre_EPI]）增加到0.464（植入后EPI [PostL_EPI]），再增加到0.693（原腸[Gast]細胞）（圖 2C）。以上結果表明猴胚胎微環(huán)境對人類(lèi)細胞的基因轉錄狀態(tài)產(chǎn)生影響，反之亦然。
由于食蟹猴的細胞在人類(lèi)細胞存在下表現出轉錄組的變化，接下來(lái)分析了嵌合胚胎中食蟹猴細胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)。首先確定了嵌合猴胚胎和對照猴胚胎之間的差異表達基因（DEG）。EPI細胞、HYP細胞和EXMCs細胞與對照胚胎相比，嵌合體細胞中分別有424、7和241個(gè)基因下調，5、2和13個(gè)基因上調（圖 2D和S3A）。GO和KEGG富集分析確定了在嵌合猴EPI細胞、HYP細胞和EXMCs細胞中上調和下調基因的信號通路，如Hippo和轉化生長(cháng)因子β（TGF-β）信號通路分別在嵌合猴EPI細胞和EXMCs細胞中下調（圖 2E）。
圖2 嵌合胚胎的發(fā)育軌跡
已經(jīng)證明食蟹猴EPI細胞的轉錄組譜在嵌合胚胎中發(fā)生了改變，接下來(lái)研究了食蟹猴EPI胚胎生態(tài)位是否也受到人類(lèi)細胞的影響。CellPhoneDB（v2.0.1）可鑒定嵌合胚胎和對照胚胎中EPI和其他譜系（HYP 和 EXMCs）之間細胞的潛在相互作用。結果發(fā)現與對照胚胎相比，嵌合胚胎中有更多的配體-受體相互作用（如，在猴EPI細胞中檢測到117個(gè) [嵌合] 與10個(gè) [對照] 特異性配體-受體相互作用）（圖 2F 和 S3B）。進(jìn)行KEGG分析發(fā)現，嵌合胚胎中被加強的信號通路包括磷脂酰肌醇 3-激酶 [PI3K]-Akt、絲裂原活化蛋白激酶 [MAPK] 信號通路和WNT信號通路（圖 2G）。使用相同的方法，還確定了嵌合胚胎內人和猴細胞-細胞的相互作用，如FGF5-FGFR4、NOTCH4-JAG2、WNT2B-FZD4、WISP3-SORL1和PLXNB2- PTN（圖 S3C 和 S3D）。結果表明，嵌合胚胎內的細胞間相互作用得到加強，并可能導致其他信號通路的激活。
圖S3 嵌合胚胎與宿主胚胎食蟹猴細胞對比分析
4、嵌合的人類(lèi)EPI-like細胞顯示出獨特的發(fā)育軌跡
EPI發(fā)展的特點(diǎn)是進(jìn)行多能性轉變，可能在物種之間表現出不同的動(dòng)態(tài)。適當的EPI分化對于嵌合體的形成和發(fā)育至關(guān)重要，本研究對嵌合胚胎內人類(lèi)EPI-like細胞的譜系分化進(jìn)行了研究，并將其與體外培養的人類(lèi)和食蟹猴胚胎的數據集進(jìn)行了比較，結果人類(lèi)EPI-like細胞在植入前、植入后和原腸胚形成階段被鑒定，并且在每個(gè)階段表達不同的標記物（圖 3A），?；鶊D也顯示了相同的人類(lèi)EPI-like細胞發(fā)育軌跡。接下來(lái)觀(guān)察到hEPSCs更類(lèi)似于早期PostE_EPI和PostL_EPI細胞。嵌合體中人PostL_EPI-like細胞與制備的PSC的相關(guān)性高于naive PSC。為了進(jìn)一步研究 hEPSC、嵌合體人類(lèi) EPI-like細胞和宿主猴EPI細胞的轉錄動(dòng)力學(xué)，本研究進(jìn)行了RNA速度和Slingshot分析（圖 3B），結果發(fā)現兩種不同的RNA速度向量模式：嵌合體人類(lèi)PostL_EPI-like細胞向量較長(cháng)，而原腸胚細胞向量較短；宿主猴PostL_EPI細胞缺乏長(cháng)向量，而原腸細胞具有長(cháng)向量（圖 3B，左邊兩張圖）。這些結果表明嵌合人類(lèi)EPI-like細胞的發(fā)育延遲。Slingshot分析顯示，hEPSCs在注入食蟹猴囊胚后，是從EPSCs到PostL_EPI再到原腸胚的發(fā)育軌跡（圖 3B，右圖）。為了進(jìn)一步描繪嵌合人類(lèi)EPI-like細胞的發(fā)育軌跡，將所有與EPI相關(guān)的人類(lèi)和猴子reads映射到一個(gè)共有基因組，并使用先前報道的方法預測物種之間EPI的發(fā)育軌跡，與RNA速度分析一致，發(fā)現嵌合人類(lèi)EPI-like細胞比來(lái)自宿主猴、對照猴和人類(lèi)胚胎的EPI細胞分化得更慢（圖 3C）。這些結果表明，hEPSCs向EPI譜系的特化和/或分化效率低于胚胎細胞。
圖3 食蟹猴胚胎中嵌合人EPI-like細胞的發(fā)育軌跡
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