2025年1月，空軍軍醫大學(xué)（第四軍醫大學(xué)）陳志南教授、秦衛軍教授、耿杰杰博士等人在學(xué)術(shù)期刊Journal for ImmunoTherapy of Cancer發(fā)表文章，題為：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma。在該文章中，研究者利用百創(chuàng )S1000空間轉錄組技術(shù)、百創(chuàng )DG1000單細胞轉錄組測序技術(shù)等，探索透明腎細胞癌異質(zhì)性，發(fā)現IL-18通過(guò)ERK/NF-κB通路促進(jìn)一種具有強免疫抑制功能的終末效應調節性T細胞產(chǎn)生，其與MRC1+FOLR2+?TAM（腫瘤相關(guān)巨噬細胞）相互作用，導致患者生存率降低、腫瘤細胞免疫逃逸增加和腫瘤生長(cháng)。該研究為認識透明腎細胞癌（ccRCC）Treg細胞異質(zhì)性以及潛在治療靶點(diǎn)提供新見(jiàn)解。
文章標題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma
期刊名稱(chēng)：Journal for ImmunoTherapy of Cancer
影響因子：10.3
合作單位：空軍軍醫大學(xué)（第四軍醫大學(xué)）
研究方法：單細胞轉錄組測序，空間轉錄組測序，流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細胞實(shí)驗。
百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng )DG1000單細胞轉錄組測序服務(wù)以及百創(chuàng )S1000空間轉錄組技術(shù)服務(wù)，文中百創(chuàng )S1000空間數據分析得到的細胞空間分布圖由百創(chuàng )開(kāi)發(fā)軟件BSTCellViewer展示。
研究背景
透明腎細胞癌ccRCC是腎細胞癌RCC的常見(jiàn)亞型，是腎癌相關(guān)死亡的主要原因，治療手段包括腎切除手術(shù)、靶向治療和免疫治療，但多數患者不能從免疫治療獲益，這與腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性有關(guān)，因此有必要深入理解ccRCC的腫瘤微環(huán)境，助力開(kāi)發(fā)新型個(gè)性化診療方案。
材料及方法
研究材料：15名腎切除術(shù)的ccRCC患者組織樣本及其血液PBMC。對組織樣本區域進(jìn)行定義，分為腫瘤核心（TC），腫瘤-健康交界（IF，包括腫瘤邊緣TR和臨近健康腎組織AN），遠端健康腎組織DN。
組別設計：實(shí)驗組4名ccRCC患者樣本進(jìn)行單細胞轉錄組測序&空間轉錄組測序，驗證組15名ccRCC患者樣本進(jìn)行流式細胞術(shù)&多重免疫熒光染色，151名ccRCC患者組織樣本&40名其他腎癌亞型患者組織樣本&6名捐獻者健康腎組織進(jìn)行多重熒光免疫組化染色。
研究方法：單細胞轉錄組測序（4名患者不同區域腫瘤組織，按照CD45+細胞:CD45-細胞=9:1增加免疫細胞數據占比，n=12），空間轉錄組測序（n=4）；流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細胞實(shí)驗。
研究結果
1.ccRCC組織細胞類(lèi)型全面分析
單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）數據顯示不同患者腫瘤組織的免疫微環(huán)境細胞組成相似，T細胞占比最高，特別是CD4+ T細胞。腫瘤區域（TC/TR）富集CD3+細胞以及CD8+ T細胞，而CD4+ T細胞基本分布在所有區域。此外，基質(zhì)細胞和免疫細胞豐度和分布存在差異，TR區域成纖維細胞比例顯著(zhù)低于TC區域和AN區域，這一發(fā)現也在空間轉錄數據中得到印證。
圖1-ccRCC組織中細胞群的全面分析
2.ccRCC細胞元程序的豐度以及異質(zhì)性
通過(guò)非負矩陣因子分解分析每個(gè)樣本scRNA-seq數據，得到可以代表ccRCC腫瘤細胞簇元程序的6個(gè)基因集，不同基因集代表著(zhù)不同的程序，如基因集1代表著(zhù)EMT（上皮-間充質(zhì)轉變）相關(guān)基因表達譜，基因集5也與EMT相關(guān)但與基因集1不同的是其包含VEGFA等。
進(jìn)一步分析，發(fā)現ccRCC亞群0~4簇與不同基因集表達譜匹配，5和6簇不與任何基因集匹配但具有細胞周期和應激響應相關(guān)基因表達。RCC0簇和RCC2簇代表EMThigh腫瘤細胞并在IF區域富集，RCC1簇代表PT（近曲小管）細胞，擬時(shí)序分析結果顯示存在RCC0—>RCC2分化關(guān)系，但RCC2幾乎只在P2患者樣本中發(fā)現，表明RCC2可能與個(gè)別患者特征相關(guān)。RCC1、RCC3和RCC4細胞主要在組織而不是腫瘤區域富集，RCC4主要分布在A(yíng)N和DN區域，RCC4在A(yíng)N區域分布數量高于DN區域。RCC4高表達細胞因子受體基因，表明TME中分泌的促腫瘤細胞因子可能傾向于作用到RCC4，增加其轉變成癌細胞的概率，加速腫瘤逃逸，促進(jìn)腫瘤惡性化，與以往瘤旁附近不是完全的健康組織認識相符合。
圖2-透明細胞RCC細胞元程序的豐度及異質(zhì)性
3.ccRCC基質(zhì)細胞的區域化特征和異質(zhì)性
scRNA-seq與空間數據均顯示，ccRCC存在8種激活的成纖維細胞簇，腫瘤區域成纖維細胞數量高于健康組織，其中CD24+IL32+成纖維細胞顯著(zhù)富集在腫瘤區域，PTGDS+成纖維細胞幾乎全分布在A(yíng)N，高表達ECM（胞外基質(zhì)）形成和EMT的成纖維細胞簇在IF較為富集，IL1R1+?CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細胞）表現出腫瘤促進(jìn)表型；7種EC（內皮細胞）簇中4種（0,2,3和6）主要富集在腫瘤組織，3種（1,4和5）在健康組織富集，膠原蛋白EC（0簇）豐度最高，具有促腫瘤特征?？傊?，不同的ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)細胞傾向于富集在IF并共定位，可能行駛多種功能，包括細胞-細胞交互和胞外組分重構。
圖3-透明細胞腎細胞癌中基質(zhì)細胞的區域特征和異質(zhì)性
4.ccRCC中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現出更強的促癌表型
scRNA-seq數據與空間數據均顯示，4種TAM簇具有不同分布趨勢，TAM1主要分布在TC區域；TAM2高表達FOLR2、MRC1和CD163，可能是M2樣巨噬細胞且具有增強的免疫抑制特征，TAM4是組織駐留巨噬細胞，兩者主要分布在TR區域；TAM3表達炎癥響應相關(guān)基因，在TR和AN區域富集。RNA速率分析顯示存在TAM4—>TAM2—>TAM1和TAM4—>TAM3兩種軌跡，以及從IF區域遷移到TC區域的趨勢。進(jìn)一步的功能分析顯示，IF區域的TAM2可能通過(guò)促進(jìn)EMT，TC區域的TAM2可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成，起到促癌效應?？傊?，TAM2不同的腫瘤促進(jìn)效應可能與免疫抑制TME有關(guān)。
圖4-透明細胞腎細胞癌中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現更強的促癌表型
5.單細胞分析揭示ccRCC中存在表達IL1B的Treg
進(jìn)一步分析CD4+ T細胞簇，發(fā)現存在CD4+ 初始T細胞、Treg和濾泡樣輔助T細胞，不同簇的特征基因和空間分布模式不同，IF區域富集CD4+ 初始T細胞和PDE3B+ CD4+ T細胞，腫瘤區域富集Treg。其中，TC/TR區域CTLA-4+?Treg的占比以及Treg的FoxP3蛋白表達水平高于A(yíng)N/DN區域，而CTLA-4+FoxP3-?Treg在所有組織中的分布較為均勻，表明腫瘤區域Treg細胞具有更強的免疫抑制功能。
進(jìn)一步分析Treg細胞簇，發(fā)現存在6種亞型，其中終末效應Treg細胞（5）主要分布在IF區域，FOXP3表達水平較低且ICOS表達水平降低，表明細胞可能處于不穩定狀態(tài)。
此外，終末效應Treg細胞表達炎癥性細胞因子如IL1B，IL18和IL7，驗證隊列的多重免疫熒光染色結果顯示IL-1β+終末效應Treg是對ccRCC特異性腫瘤微環(huán)境信號的特異性響應。發(fā)現腫瘤組織中存在表達炎癥性細胞因子IL1B的終末效應Treg細胞。
圖5-單細胞分析揭示透明細胞腎細胞癌存在表達IL1B的Treg細胞群
6.IL-18通過(guò)ERK/NF-κB通路促進(jìn)強免疫抑制功能的終末效應Treg細胞產(chǎn)生
空間轉錄組數據結果顯示不同Treg細胞100μm范圍內激活的CD4+/CD8+ T細胞數量較少，終末效應Treg細胞100μm范圍內CD4+/CD8+ T細胞數量更少，表明終末效應Treg細胞周?chē)鷳餞reg細胞（Tresp）增殖受到更強的抑制。細胞共培養實(shí)驗表明終末效應Treg細胞具有強免疫抑制功能。RNA速率分析結果表明效應終末Treg可能由初始Treg細胞分化而來(lái)，體外實(shí)驗表明IL-18可刺激CD4+CD25+ Treg細胞上調IL-1β表達，表明終末效應Treg細胞產(chǎn)生和作用可能與IL-18有關(guān)。ERK激活劑/NF-κB激活劑促進(jìn)IL-18+ Treg細胞的產(chǎn)生，IL-18處理后Treg細胞ERK/NF-κB磷酸化水平增加，ERK抑制劑可抑制Treg細胞表達NF-κB但NF-κB抑制劑無(wú)法抑制ERK表達，綜上，這些結果表明IL-18可能通過(guò)ERK/NF-κB通路介導終末效應Treg細胞的產(chǎn)生。
圖6-IL-18通過(guò)ERK/NF-κB通路促進(jìn)具有強免疫抑制功能的終末效應Treg細胞產(chǎn)生
7.通過(guò)與MRC1+FLOR2+?TAM互作，終末效應Treg細胞與存活率降低、免疫逃逸增加及腫瘤生長(cháng)相關(guān)
確定終末效應Treg細胞標志基因（FOXP3、IL1B和FCER1G），TGCA泛癌數據庫數據分析結果顯示，終末效應T細胞浸潤高的隊列與更低的整體存活率相關(guān)。細胞通訊分析結果顯示，巨噬細胞與終末效應Treg細胞有著(zhù)最多的互作配體-受體對，許多是免疫抑制互作，驗證實(shí)驗支持終末效應Treg細胞與TAM2簇之間存在相互作用；IL1R1+?CAF與終末效應Treg細胞也存在潛在聯(lián)系。僅在TC區域（與TR區域相比）發(fā)現NAMPT-INSR和TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)配受體互作，體外實(shí)驗發(fā)現終末效應Treg細胞LRRC32（該基因編碼的GARP是TGF-β1成熟和激活所必須的）表達水平高于傳統Treg細胞。
此外，巨噬細胞特別是TAM2高表達IL18。這些結果可能表明ccRCC腫瘤微環(huán)境中，IF區域終末效應Treg細胞與臨近TAM2互作，通過(guò)分泌的TGF-β1、M-CSF1以及IL-10，將IF駐留的TAM轉變成促癌表型，引起腫瘤細胞EMT；TAM2分泌的趨化因子誘導Treg細胞遷移到腫瘤區域并過(guò)表達IL-18，將Treg細胞轉變成IL-1β+ 終末效應T細胞，抑制T細胞免疫并促進(jìn)腫瘤生長(cháng)。
總之，這些結果表明ccRCC的IF區域，終末效應Treg細胞可能與其他促癌細胞互作，最終促進(jìn)腫瘤細胞惡性轉化，支持了終末效應Treg細胞具有免疫抑制和促癌作用的假設。
研究結果
該研究系統描述了ccRCC中不同類(lèi)型細胞的基因表達譜和空間分布規律，發(fā)現一種具有癌癥促進(jìn)作用的新Treg細胞亞型，在腫瘤-健康組織交界區域與MRC1+FOLR2+?TAM互作，構建免疫抑制TME，促進(jìn)腫瘤細胞惡性轉化最終引起患者存活率降低。同時(shí)，這些發(fā)現也為開(kāi)發(fā)新的藥物和預后標志物提供了靶點(diǎn)。
參考文獻：
Song X, et al. Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2025 13(1):e010183.
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