外顯子是基因組中能夠轉錄組出成熟RNA的部分，外顯子組(exome)是基因組中所有外顯子的集合。人類(lèi)擁有約18萬(wàn)個(gè)外顯子，約占人類(lèi)基因組的1%，即約3000萬(wàn)個(gè)bp(30MB)。全外顯子組測序是指通過(guò)探針捕獲基因組中外顯子區域的DNA序列，并進(jìn)行集中測序分析，從而找到致病變異或鎖定與疾病相關(guān)的基因，對于遺傳性疾病及腫瘤等病變病理成因確認以及治療靶點(diǎn)鎖定有重要作用。
沈陽(yáng)醫學(xué)院高兵教授團隊在?Redox Biology?雜志發(fā)表題為“ Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation ”?的研究論文，結合全外顯子測序與轉錄組等組學(xué)數據分析，解釋ATP1A1在腎晶體形成中起到的重要作用，表明ATP1A1可能是治療鈣結石的潛在治療靶點(diǎn)。ong>
英文標題：Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation
中文標題：腎結石病的Meta數據分析揭示ATP1A1參與腎晶體形成
發(fā)表期刊：Redox Biology
合作單位：沈陽(yáng)醫學(xué)院
影響因子：10.7
研究對象：CaOx腎結石患者及對照組樣本
研究方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數據分析
百邁客生物為該研究提供了外顯子測序服務(wù)。
研究背景
腎結石在全球范圍內都威脅著(zhù)人類(lèi)的生命健康，近年來(lái)發(fā)病率和復發(fā)率都不斷上升，大多數腎結石由草酸鈣（Calcium ox）結石組成，晶體-細胞粘附被認為是晶體保留和結石形成中的關(guān)鍵步驟，有研究報道，受損的腎小管上皮細胞對晶體附著(zhù)的親和力增加，而晶體沉積通過(guò)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS）反過(guò)來(lái)又誘導細胞損傷和炎癥反應。Na/K-ATPase（NKA）是一種在腎臟中高度表達的跨膜離子泵，同時(shí)其由ATP1A1編碼的α1亞基也起到信號轉導器的作用，當?ATP1A1?構象改變或被敲低時(shí)，Src 就會(huì )被磷酸化并激活下游信號級聯(lián)，進(jìn)而導致 ROS 的產(chǎn)生，ROS可以激活MAPK級聯(lián)反應和NF-κB炎癥反應，并作為ATP1A1的配體啟動(dòng)ATP1A1/Src信號通路，從而形成NKA/ROS擴增環(huán)，誘導氧化應激，然而，ATP1A1在腎結石形成中的作用尚不清楚。本實(shí)驗結合多組學(xué)分析方法，以期提供一種有用的方法，研究腎結石形成病理。
材料方法
實(shí)驗材料：28例中國漢族CaOx腎結石患者及對照組樣本
組學(xué)方法：全外顯子測序（WES）+表達譜數據分析
研究結果
首先該研究從GEO數據中獲取了腎臟鈣結石患者的表達譜數據化，其中患者的RP組織（Randall斑塊）命名為P組，患者的正常組織命名為N組，對其表達譜篩選基因進(jìn)行WGCNA分析，選擇與樣本相關(guān)性較高的淺橙色模塊（434個(gè)基因）進(jìn)行后續研究，GO富集結果表明這些基因在質(zhì)膜和跨膜轉運中富集。KEGG富集分析顯示，這些基因參與“醛固酮調節的鈉重吸收”、“礦物質(zhì)吸收”、“內分泌等因子調節的鈣重吸收”和“近端小管碳酸氫鹽回收”等通路，進(jìn)一步查看發(fā)現，FXYD2、FXYD4、ATP1A4、ATP1A1和ATP1B1等5個(gè)編碼NKA的基因參與了跨膜轉運、吸收和重吸收的過(guò)程，表明NKA可能與腎結石密切相關(guān)。
為進(jìn)一步探究腎結石相關(guān)關(guān)鍵基因，該研究對28例中國漢族CaOx結石患者進(jìn)行了WES分析，共鑒定得到76個(gè)SNPs，其中錯義SNPs31個(gè)，編碼同義SNPs30個(gè)，3′UTR7個(gè)SNPs，5′UTR區8個(gè)SNPs，作為候選SNPs，這些突變位點(diǎn)定位于67個(gè)基因，將這67個(gè)基因與WGCNA分析中的434個(gè)基因做韋恩圖取交集，發(fā)現ATP1A1是兩個(gè)數據集交叉點(diǎn)中的唯一基因，一定程度上說(shuō)明了ATP1A1在鈣結石形成中的潛在作用。
接下來(lái)，該研究從WES數據中提取了ATP1A1的SNP，rs11540947 T等位基因在患者組中的突變頻率頻率為16.1%，而對照組僅為2.4%。為進(jìn)一步證實(shí)rs11540947與鈣結石形成的相關(guān)性，收集214例鈣結石患者和232例匹配對照，通過(guò)HRM分析檢測rs11540947的基因型，結果顯示，CT+TT攜帶者在患者中比對照組更常見(jiàn)，且在男性中與鈣結石有關(guān)，但在女性中無(wú)顯著(zhù)相關(guān)性，SNPrs11540947 （NM_000701:c.-78C > T）位于?ATP1A1?的 5′UTR 中；在A(yíng)TP1A1的5′UTR中發(fā)現了Sp1結合位點(diǎn)和潛在的TATA盒，表明5′UTR具有啟動(dòng)子活性，雙熒光素酶報告基因結果也證明了這一點(diǎn)，rs11540947的T等位基因介導了ATP1A1啟動(dòng)子活性的顯著(zhù)降低，這可能會(huì )降低ATP1A1在轉錄水平的表達。對草酸鈣一水合物（COM）暴露處理的HK2細胞（人腎近曲小管上皮細胞）進(jìn)行指標測定，結果顯示處理3h后，NKA酶活性和ATP1A1 mRNA水平顯著(zhù)下降，6h后ATP1A1的蛋白水平升高，隨后降低，同時(shí)COM 暴露后細胞內 ROS 水平顯著(zhù)增加，這可能與ATP1A1/Src信號通路的激活有關(guān)，而ATP1A1的過(guò)表達抑制了COM誘導的Src、p38、JNK、p65和p50激活；WB結果也顯示COM激活的半胱天冬酶3被ATP1A1的過(guò)表達以及ATP1A1/Src信號復合物的特異性拮抗劑pNaKtide顯著(zhù)抑制，從而阻斷了細胞凋亡過(guò)程。
晶體與細胞的粘附是結石形成的關(guān)鍵過(guò)程，晶體沉積會(huì )損傷腎細胞，因此，作者研究了ATP1A1在晶體-細胞粘附中的作用。該研究觀(guān)察到用 Ad-hATP1A1 感染和用 pNaKtide 處理后，Ca2+濃度與對照組相比顯著(zhù)降低，表明ATP1A1過(guò)表達和pNaKtide可以阻止晶體與細胞的粘附，從而保護細胞免受CaOx晶體誘導的損傷并減少腎結石的形成。DNA啟動(dòng)子中CpG島的甲基化是基因沉默的常見(jiàn)機制，COM暴露后，DNA甲基轉移酶（DNMTs）的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著(zhù)升高，而用DNA甲基化抑制劑5Aza-2dc預處理HK2細胞再進(jìn)行COM暴露處理后，ATP1A1表達量下調；ATP1A1的蛋白水平也被逆轉。這些結果表明，改變的DNA甲基化參與了COM誘導的ATP1A1降低。
為了證實(shí)ATP1A1對體內晶體形成的影響，該研究構建了CaOx腎病大鼠模型，用 pNaKtide 治療后尿草酸鹽排泄量顯著(zhù)減少，與體外研究結果類(lèi)似，HYP+CaCl2處理降低了 ATP1A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，激活了 Src、p38、JNK、p65 和 p50，降低 Nrf2 表達，而這些均被pNaKtide逆轉，這些結果強調了ATP1A1和ATP1A1/Src信號通路在腎結石形成中的重要性。
研究總結
綜上所述，該研究從遺傳水平和環(huán)境因子影響的轉錄水平探究腎結石相關(guān)關(guān)鍵易感基因，將鈣結石形成者Randall斑塊（RP）組織的基因表達譜數據與CaOx患者的WES數據相結合，鑒定出ATP1A1這一關(guān)鍵基因，還研究了ATP1A1遺傳變異與鈣結石風(fēng)險的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步探討了ATP1A1/Src/ROS信號在體外和體內腎結石形成中的作用，這項研究的發(fā)現揭示了ATP1A1基因變異及其表達降低參與腎晶體形成的機制，可能為CaOx結石提供潛在的治療靶點(diǎn)。
參考文獻：
Li Y, Lu X, Yu Z, Wang H, Gao B. Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation.?Redox Biol. 2023 May;61:102648. doi: 10.1016/j.redox.2023.102648. Epub 2023 Feb 27. PMID:36871182.
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