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2024年5月，寧夏回族自治區人民醫院在國際學(xué)術(shù)期刊Aging發(fā)表一項重要研究成果，題為：Single-cell BCR and transcriptome analysis reveals peripheral immune signatures in patients with thyroid-associated ophthalmopathy。使用單細胞RNA測序 (scRNA-seq)、scBCR-seq來(lái)剖析甲狀腺相關(guān)眼病患者外周免疫特征。

文章標題：Single-cell BCR and transcriptome analysis reveals peripheral immune signatures in patients with thyroid-associated ophthalmopathy

期刊名稱(chēng)：Aging.

合作單位：寧夏回族自治區人民醫院

研究部位：眼

研究方法：scRNA-seq、scBCR-seq、流式細胞術(shù)

百邁客生物為該研究提供了單細胞測序服務(wù)。

 

研究背景

甲狀腺相關(guān)性眼?。═hyroid-associated Ophthalmopathy， TAO）是一種眼眶特異性自身免疫性疾病，可導致毀容，并可能導致失明。目前，TAO的病因尚不清楚。TAO可與甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲減癥合并使用，甲狀腺功能正常的患者數量逐年增加。它是一種器官特異性自身免疫性疾病，與甲狀腺功能有關(guān)，相對獨立。具有特征性眼部體征的TAO的常見(jiàn)癥狀是眼瞼回縮，伴或不伴眼突出，占所有 TAO的70-80%。它是Graves?。℅raves’s disease，GD）的主要甲狀腺外表現，約20%-50%的GD患者受累。由于對其潛在免疫畸變的了解有限，因此開(kāi)發(fā)有效的治療方法受到限制。

實(shí)驗材料

采用scRNA-seq和單細胞BCR測序 (scBCR-seq) 技術(shù)來(lái)研究具有活性TAO、不活性TAO和NC的個(gè)體之間細胞組成和BCR庫的變化。

1、scRNA-seq、scBCR-seq

使用來(lái)自6名TAO患者和3名NC的血液樣本進(jìn)行scRNA-seq和scBCR-seq。

2、流式細胞術(shù)

15名非活動(dòng)性TAO患者、7名活動(dòng)性TAO患者和10名NC用于流式細胞術(shù)分析。

研究結果

1.TAO患者外周免疫細胞的單細胞轉錄譜

為了了解疾病不同階段單細胞轉錄組的異質(zhì)性，該研究根據CAS標準將TAO患者分為兩組：眼眶炎癥明顯的為活動(dòng)組，臨床癥狀輕微的為非活動(dòng)組。從每位受試者的全血中分離出PBMC以供進(jìn)一步研究。

該研究使用10x Genomics Chromium平臺對總共9個(gè)樣本進(jìn)行了scRNA-seq。經(jīng)過(guò)初步質(zhì)量控制后，總共獲得了93,007個(gè)PBMC用于后續分析，其中包括來(lái)自活性TAO的23,051個(gè)細胞、來(lái)自非活性TAO的34797個(gè)細胞和來(lái)自正常對照 (NC) 的35,159個(gè)細胞?；趫D的聚類(lèi)分析確定了17個(gè)不同的聚類(lèi)。在手動(dòng)確認細胞類(lèi)型注釋后，該研究成功將簇分為五種主要的PBMC細胞類(lèi)型。其中包括各種CD4+ T細胞群 (CD4+)、NK (CD56+)、CD8+T細胞 (CD8A+)、B細胞 (CD19+) 和骨髓細胞 (CD11b+)（圖1A，1B）。通過(guò)流式細胞術(shù)分析驗證了scRNA-seq鑒定的這五種細胞類(lèi)型的存在（圖1C）。值得注意的是，17個(gè)細胞簇中的12個(gè) (70.6%) 包含來(lái)自多個(gè)單獨樣本的至少100個(gè)細胞，每個(gè)簇內平均有9個(gè)單獨樣本。

接下來(lái)，該研究試圖根據疾病階段檢查這些人群的患病率變化。作者計算了通過(guò) scRNA分析識別的每個(gè)簇相對于每個(gè)患者樣本的簇總數的百分比（圖1D）。研究結果顯示，患者的免疫特征存在顯著(zhù)差異，活性TAO顯示顯著(zhù)的B細胞浸潤 (p=0.047) 和骨髓細胞浸潤 (p=0.008) 。相比之下，NK細胞主要在非活性TAO (p=0.022) 和 NC (p=0.059) 中觀(guān)察到。盡管差異未達到統計學(xué)顯著(zhù)性，但非活性TAO和NC樣本均顯示出CD4+T細胞的富集。CD8+T細胞的比例在這些樣本組中表現出最小的變化。這些發(fā)現強調了活躍TAO個(gè)體中PBMC組成的變化，強調了深入了解細胞亞型多樣性和與疾病階段相關(guān)的狀態(tài)的重要性。

2.調節性B細胞參與TAO期間的免疫調節

為了全面了解B細胞的異質(zhì)性及其在TAO中的作用，該研究基于RNA-seq數據進(jìn)行了進(jìn)一步分析，以確定其不同的亞群。使用基于圖的聚類(lèi)，該研究確定了五個(gè)亞群，總共包含9493個(gè)B 細胞（圖2A）。此外，該研究徹底評估了與B細胞譜系相關(guān)的一組綜合基因的表達，以更深入地了解它們的獨特特征。濾泡B細胞的特征是表達IGHD(IgD)和CD23（也稱(chēng)為FCER2）。邊緣區B群體表現出JCHAIN(IgM) 和CD21的高表達。Bregs根據CD1d、CD5、CD19、CD24、CD38和CD27的表達進(jìn)行鑒定。此外，生發(fā)中心B細胞被認為是顯示高水平CD20 (MS4A1)、CD38?和FCRL3的簇。最后，少量B細胞被鑒定為多淋巴祖細胞，表達CD45RA (PTPRC)、CD34和CD10(MME)（圖2B）。每個(gè)B細胞亞群的前10個(gè)不同表達基因 (DEG) 為該研究的注釋提供了額外的證據，并支持每個(gè) B 細胞亞群的獨特身份和功能特征。

隨后檢查了疾病不同階段每個(gè)樣本中的B細胞組成。雖然三組的Bregs相對比例沒(méi)有顯著(zhù)差異，但與非活動(dòng)TAO組和正常對照組相比，活動(dòng)TAO中的Bregs比例較低（p=0.078和p=0.065）（圖2D）。盡管觀(guān)察到的差異未達到統計顯著(zhù)性，但這一結果表明了數據的潛在趨勢。為了驗證這些結果，該研究進(jìn)行了流式細胞術(shù)分析，并使用CD19+IL-10+作為識別Bregs細胞群的標記。IL-10由于其抑制促炎癥反應的能力而被廣泛認為是Breg的標志。該分析證實(shí)，與非活動(dòng)TAO和NC組相比，活動(dòng)TAO中的Breg頻率降低（圖2E）。

進(jìn)行軌跡分析以闡明不同B細胞亞群之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系。分析發(fā)現了3個(gè)分支點(diǎn)和5 個(gè)不同的狀態(tài)。狀態(tài)1的特征是邊緣區B細胞和FCRL3高GC B細胞同時(shí)分布。狀態(tài) 2由一小部分濾泡B細胞組成。狀態(tài)3主要由濾泡B細胞組成。狀態(tài)4和狀態(tài)5主要由 Breg組成。此外，所有狀態(tài)都表現出彌散的多淋巴細胞祖細胞（圖2F）。與之前的發(fā)現一致，該研究觀(guān)察到活性TAO中處于狀態(tài)4和狀態(tài)5的Bregs細胞密度降低。根據SCENIC分析，發(fā)現一組受不同轉錄因子調控的獨特基因在Bregs中特異性表達，而在其他細胞類(lèi)型中幾乎不存在（圖2G）。在Bregs中，受RORA、CEBPD、PRDM1、FOSL2和EOMES調控的基因顯示出明顯更高的表達水平。

GO富集分析顯示，Bregs表現出與免疫調節（AIF1、CSK、HLA-DRB5、CYBA）、細胞周期進(jìn)程、信號轉導和細胞凋亡相關(guān)的上調基因（ARPC1B、CORO1A、YWHAB），（RHOA，CLIC1，S100A6，NME2）（圖2H，2I）。值得注意的是，在活躍的TAO中，Bregs上調的基因在炎癥相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)和細胞過(guò)程相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)中豐富。這些發(fā)現強烈表明Bregs可能在TAO過(guò)程中調節炎癥和免疫反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用。根據CellPhoneDB分析，Bregs表現出與骨髓細胞的高頻率通信（圖2J）。這一發(fā)現表明Breg和骨髓細胞可能在TAO期間參與協(xié)調的免疫調節過(guò)程。

3.scBCR-seq分析發(fā)現活性TAO中BCR多樣性顯著(zhù)增加

為了全面分析B細胞群中的基因表達和BCR多樣性，該研究對scRNA-seq分析中使用的PBMC樣本進(jìn)行了scBCR-seq。在活性TAO中，前10個(gè)克隆型的比例（0.17%）與非活性組（0.37%，p=0.010）和NC組（0.41%，p=9.31E-05）（圖3A）。然而，對互補決定區3 (CDR3) 長(cháng)度的分析沒(méi)有顯示任何明顯的變化（圖3B）。當檢查CDR3的多樣性時(shí)，通過(guò)Chao1指數量化，與NC組 (p=0.016) 和非活動(dòng)TAO組 (p=0.002) (圖3C)。Breg細胞中也出現了類(lèi)似的趨勢（圖 3D），與NC組相比顯著(zhù)增加（p=0.011），但活性TAO之間沒(méi)有統計學(xué)顯著(zhù)差異組和NC組 (p=0.213)。這些發(fā)現表明，雖然活性TAO中前10個(gè)克隆型的頻率降低，但在這種情況下CDR3序列的多樣性增加，這可能對免疫反應的調節有影響，并有助于活性TAO的發(fā)病機制。

4.活性TAO中骨髓細胞結構的改變

為了評估骨髓細胞在TAO中的參與情況，該研究鑒定了骨髓細胞的主要亞型，并檢查了它們在活性TAO中的配置。分析顯示了五種不同的骨髓細胞群，即單核細胞、巨核細胞、樹(shù)突狀細胞 (DC)、單核細胞衍生的DC和紅細胞（圖4A ）。這些細胞類(lèi)型的鑒定基于差異基因表達和對已建立的譜系標記的檢查（圖4B）?；钚訲AO 和非活性TAO之間的比較揭示了單核細胞和DC比例的顯著(zhù)差異。與非活動(dòng)TAO組相比，活動(dòng)TAO患者的單核細胞比例顯著(zhù)較高 (p=0.006)，而活動(dòng)TAO中DC的比例顯著(zhù)較低 (p= 0.003) (圖4C)。這些發(fā)現表明，單核細胞水平增加和DC數量減少可能是TAO患者活動(dòng)性疾病狀態(tài)的特征。

5.DCs可能參與TAO活躍期間的炎癥過(guò)程

DC被細分為三個(gè)不同的子簇。Cluster 0被指定為cDC1s，其特征是高表達CDKN1C、FCGR3A、SMIM25、IFITM3、LST1和MS4A7，以及CD1C和 CD141的低表達。簇1和簇2被鑒定為cDC2，其炎癥基因的表達水平升高，例如 CD14、S100A8、GNLY、NKG7 、IL32和S100A12（圖5A、5B）。cDC1s的比例在活性TAO中顯著(zhù)較高，而cDC2s在非活性TAO和NC中更為普遍（圖 5C）。鑒于cDC1和cDC2在免疫調節中發(fā)揮不同的作用- cDC1專(zhuān)門(mén)誘導Th2反應，而cDC2亞群表現出更強大的誘導Th1反應的能力[42]，該研究進(jìn)一步檢查了它們的基因表達譜。

關(guān)于cDC1，與MHC II抗原呈遞（HLA-DRB5、IFI30）、免疫激活（NAPSB）以及發(fā)育和神經(jīng)遺傳相關(guān)的基因與NC相比，疾病 (NBPF14) 在活性TAO中高度表達（圖5D、5E）。對于cDC2，與NC相比，在活性TAO中觀(guān)察到更高水平的 HLA-DRB5和FCN1（圖5D，5E）。富集分析表明，對于兩種DC，活性TAO中上調的基因主要與炎癥、免疫激活途徑和補體激活途徑相關(guān)的各種過(guò)程相關(guān)（圖 5F）。這些結果表明，在活躍的TAO中，DC的活化可能受到損害，并且在此活躍階段觀(guān)察到的炎癥可能與這些細胞密切相關(guān)。

6.單核細胞通過(guò)調節炎癥細胞因子的產(chǎn)生在活性TAO中發(fā)揮作用

作者的聚類(lèi)分析成功地從總共 12,959 個(gè)單核細胞中識別出三個(gè)不同的亞群。第一個(gè)簇的特征是經(jīng)典單核細胞 (CMO)，其表現出高表達水平的CD14、S100A8 和 S100A9。第二個(gè)簇被鑒定為非經(jīng)典單核細胞 (NMO)，其特征是高表達FCGR3A（也稱(chēng)為 CD16）。第三簇被識別為中間單核細胞 (IMO)，CD14和FCGR3A均高表達（圖6A、6B）。為了驗證這些單核細胞亞簇，進(jìn)行了流式細胞術(shù)分析，確認 CMO為CD14++CD16-，NMO為CD14+CD16++，IMO為CD14++CD16+（圖6C）。軌跡推斷分析表明，單核細胞遵循從CMO開(kāi)始并向NMO和IMO狀態(tài)分支的發(fā)育軌跡（圖6B）。這些對TAO期間單核細胞發(fā)育狀態(tài)變化的觀(guān)察表明它們在該疾病中的潛在作用。

7.TAO中Breg細胞和骨髓細胞之間的串擾

進(jìn)一步檢查了活躍TAO背景下Breg、DC和單核細胞之間的細胞相互作用。該分析總共確定了1,352對重要的相互作用。值得注意的是，Bregs被發(fā)現表現出最多數量的配體，而cDC1亞簇則表現出最多數量的受體。值得注意的是，與非活性TAO 和正常對照組(NC)相比，Bregs在活性TAO中顯示出配體數量增加（圖7A）。

該研究對與炎癥和免疫激活相關(guān)的相應受體和配體的表達模式進(jìn)行了詳細分析。與非活動(dòng)性TAO組和正常對照(NC)組相比，活動(dòng)性TAO患者中Breg與cDC1、cDC2、IMO、NMO或CMO之間的CD22-PTPRC相互作用明顯更強（圖7B）。此外，該研究觀(guān)察到活性TAO中存在強大的抑制相互作用，例如Bregs和cDC1、cDC2或IMO之間的BTLA-TNFRSF14。這一發(fā)現表明，在TAO活躍的情況下，Bregs可能發(fā)揮更大的免疫抑制作用（圖7B）。

通過(guò)檢查在免疫抑制和炎癥過(guò)程中具有潛在作用的基因的表達水平，研究發(fā)現活躍 TAO期間Breg中的CD22、PTPRC、BTLA和TNFRSF14增高。此外，與非活性TAO和正常對照(NC)組相比，活性TAO中的Breg、DC和單核細胞中BTLA和 TNFRSF14的表達水平總體增加（圖 7C）。這些發(fā)現表明，在活躍的TAO過(guò)程中，Breg、DC和單核細胞之間存在復雜的調節相互作用，這可能有助于在疾病中觀(guān)察到的炎癥和免疫反應。

研究總結

該研究強調了具有活性TAO、非活性TAO和NC的個(gè)體中B細胞、DC和單核細胞的比例和轉錄異質(zhì)性的顯著(zhù)變化。這些發(fā)現為了解活躍TAO期間外周免疫環(huán)境中免疫細胞浸潤的變化提供了寶貴的見(jiàn)解。

值得注意的是，該研究發(fā)現了兩個(gè)配體-受體對CD22-PTPRC和BTLA-TNFRSF14的潛在抑制作用，這可能有助于減少Bregs 并削弱活性TAO中炎癥的抑制作用。這些潛在的致病細胞和分子可能是TAO炎癥變化的原因，因此可能被確定為該疾病的新治療靶點(diǎn)。

此外，該研究描述了TAO中BCR庫的免疫特征，揭示了活躍TAO期間BCR多樣性的顯著(zhù)增加。該研究揭示了活性TAO中觀(guān)察到的炎癥反應的分子和細胞基礎。通過(guò)更好地了解這種情況下的免疫失調，該研究為未來(lái)開(kāi)發(fā)更有效的免疫治療策略奠定了基礎。隨著(zhù)對潛在機制的進(jìn)一步驗證和探索，這些發(fā)現有可能為T(mén)AO患者的靶向和個(gè)性化治療做出重大貢獻。