ATAC-seq即染色質(zhì)開(kāi)放性檢測,是基于高通量測序手段研究染色質(zhì)轉座酶可接近性的一種技術(shù)，可以獲得全基因度尺度上處于開(kāi)放狀態(tài)的染色質(zhì)區域活躍轉錄的調控序列，從而分析潛在的活躍轉錄因子及其靶基因，目前已廣泛應用于病理生理調控機制、藥物靶點(diǎn)發(fā)現、耐藥機制探究等方向，與轉錄組結合可構建轉錄因子協(xié)同調控網(wǎng)絡(luò )；ONT全長(cháng)轉錄組是利用ONT長(cháng)讀長(cháng)測序平臺，無(wú)需打斷，完整測到轉錄本全長(cháng)序列，相比于常規轉錄組，可在準確分析轉錄本水平的表達量的同時(shí)，對序列結構進(jìn)行準確解析，得到可變剪切、可變多聚腺苷酸、融合基因等分析結果。
四川省人民醫院龔波研究員在Journal of Genetics and Genomics雜志發(fā)表題為“ Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma ” 的研究論文，結合ATAC-seq與ONT全長(cháng)轉錄組，揭示FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的致癌作用等。
中文標題：全長(cháng)轉錄組及ATAC協(xié)助解析神經(jīng)膠質(zhì)瘤致癌基因FAM20C調控
英文標題：Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma
期刊名稱(chēng)：Journal of Genetics and Genomics
合作單位：四川省人民醫院
研究對象：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁組織
測序技術(shù)：ONT全長(cháng)轉錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等
百邁客為該研究提供了全長(cháng)轉錄組及ATAC等測序技術(shù)服務(wù)。
研究背景
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統中最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，攻擊力極強，約占所有腦腫瘤的80%，目前主要的癌癥治療方案，包括手術(shù)切除、放療和化療，都會(huì )導致預后不良和高死亡率，很難對膠質(zhì)瘤提供理想的治療效果，因此現在迫切需要探索新的有效策略以及膠質(zhì)瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)。長(cháng)讀長(cháng)RNA測序技術(shù)已應用在包括肝細胞癌和非小細胞肺癌等多種癌癥類(lèi)型中，ATAC-seq也已經(jīng)應用于胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤研究中。FAM20C是一種可調節分泌途徑中的各種網(wǎng)絡(luò )的分泌蛋白，主要負責礦化激酶，然而越來(lái)越多的研究表明，FAM20C?與包括包括乳腺癌、膀胱癌和結直腸癌在內的多種癌癥廣泛相關(guān)。
材料方法
材料：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁（病灶旁2cm處）組織樣本
方法：ONT全長(cháng)轉錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等
研究結果
用三對膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為發(fā)現組進(jìn)行了ONT全長(cháng)轉錄組測序，之后又用另外6對膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為鑒定組進(jìn)行了ONT全長(cháng)轉錄組測序，兩次測序中發(fā)現共有差異基因（DEG）503 個(gè)，在癌癥相關(guān)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Ras信號通路中顯著(zhù)富集。另外，差異基因也在神經(jīng)元活動(dòng)通路中富集，表明神經(jīng)元激活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)，這與最近的研究一致，已經(jīng)有研究證明，突觸粘附分子神經(jīng)粘附蛋白-3（NLGN3）的活性依賴(lài)性裂解和分泌介導了腦癌神經(jīng)調控，有助于通過(guò)PI3K-mTOR途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖，而PIK3CA 變體已被證明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生過(guò)程中選擇性地啟動(dòng)大腦過(guò)度活躍，并在神經(jīng)元環(huán)境的腫瘤重塑中增加活性發(fā)揮重要作用。因此，鑒定出的神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)DEGs為神經(jīng)元和膠質(zhì)瘤細胞之間串擾的前瞻性研究奠定了基礎。
APA分析結果顯示，在發(fā)現數據集以及鑒定數據集中，共鑒定到了12492個(gè)APA事件，兩組各自有97例和260例APA事件顯示出顯著(zhù)差異，且各有52例和65例APA在兩組中顯示存在多A位點(diǎn)，為了分析APA事件與差異表達基因的關(guān)系，結果中比較了差異APA及差異基因集合，發(fā)現大部分共有基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中APA 信號和表達都呈現較低水平，這意味著(zhù)更多的多聚腺苷酸化可能有助于 mRNA 的穩定性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的APA事件與基因表達高度相關(guān)，表明APA事件在這些基因的失調和膠質(zhì)瘤發(fā)病機制中起著(zhù)關(guān)鍵作用。
為了探究神經(jīng)膠質(zhì)瘤中基因的轉錄調控，對發(fā)現數據集中的6個(gè)樣本進(jìn)行了ATAC測序，鑒定出與1129個(gè)基因關(guān)聯(lián)的1176個(gè)差異峰（DPs），如預期所料，大多數DPs分布在基因結構的近端啟動(dòng)子區域，結果中觀(guān)察到兩個(gè)增加的Glypican 1（GPC1）DPs信號，其中一個(gè)位于啟動(dòng)子中，另一個(gè)位于第一個(gè)內含子區域。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中還觀(guān)察到蛋白酪氨酸磷酸酶受體 B 型 （PTPRB） 的 DP 信號降低（內含子區），隨后將1129個(gè)DPs相關(guān)基因和503個(gè)常見(jiàn)DEGs進(jìn)行比較，找到交集的22個(gè)基因，結合CGGA數據庫分析對應表達，發(fā)現有16個(gè)基因顯著(zhù)差異表達，針對這16個(gè)基因的患者生存率分析發(fā)現，僅?RAB3A?和?FAM20C?同時(shí)具有預后及臨床的意義，另外這22個(gè)基因中，NPTN基因也是目前研究熱度較高的基因。通過(guò)qRT-PCR和免疫組化（IHC）染色驗證了NPTN和FAM20C在我們收集的神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達，在膠質(zhì)瘤較高階段的樣品中觀(guān)察到NPTN的表達顯著(zhù)降低，相反，FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達顯著(zhù)增加，特別是在IV期，IHC 染色進(jìn)一步驗證了?NPTN?通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展到晚期來(lái)抵消?FAM20C?的致癌功能。
最后，為了探索與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中?FAM20C?和?NPTN?失調相關(guān)的轉錄因子，從在線(xiàn)數據庫 ChIP-Atlas 下載組蛋白標記物（H3K4me 和 H3K27ac）的 ChIP 數據，并用TCGA數據集驗證這些轉錄因子在FAM20C或NPTN中的表達，最終結果表明，在TCGA數據集中，REST與FAM20C的相關(guān)系數最高。鑒定出兩個(gè)反式活性因子（BRD4 和 REST）與?FAM20C?和?NPTN?均呈正相關(guān)。結合染色質(zhì)可及性、TFs 結合位點(diǎn)和 APA 分析共同影響基因表達，結果表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中NPTN的表達顯著(zhù)降低，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中觀(guān)察到的峰值信號增加。此外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN的APA數量明顯小于對照組。因此，提出了APA編號在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN基因表達的轉錄調控中占主導地位的假設，本研究開(kāi)創(chuàng )了FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床意義、體外功能和樞紐轉錄因子。值得注意的是，FAM20C 抗體顯著(zhù)消除了?FAM20C?異位表達引起的腫瘤大小增加，總之，本項研究證明了轉錄激活的?FAM20C?是一種致癌基因，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有治療意義。
參考文獻：
Gong B, Liang Y, Zhang Q, Li H, Xiao J, Wang L, Chen H, Yang W, Wang X, Wang Y, He Z. Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma.?J Genet Genomics. 2023 Jun;50(6):422-433. doi:10.1016/j.jgg.2023.01.008. Epub 2023 Jan 25.
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