項目文章IF＞50！ | 百創(chuàng )S系列空轉細胞分割技術(shù)助力揭示肢端型黑色素瘤的克隆演化規律

空間組學(xué)技術(shù)正在廣泛應用腫瘤微環(huán)境分析，高通量高分辨率空間轉錄組技術(shù)如何在單細胞分辨率維度剖析腫瘤細胞與免疫細胞在空間位置上真實(shí)互作？今天小編給大家帶來(lái)北京大學(xué)第一醫院的張寧、李航及北京大學(xué)-云南白藥國際醫學(xué)中心薛瑞棟團隊合作于2024年5月在Cancer Cell在線(xiàn)發(fā)表題為《Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma》的研究論文，利用多組學(xué)技術(shù)解析原位肢端型黑色素瘤到侵襲性腫瘤的克隆演變規律，并高精度揭示了APOE⁺/CD163⁺巨噬細胞的空間富集狀態(tài)和EMT腫瘤細胞的互作，發(fā)現APOE和CD163可用于預測iAM的預后，為肢端型黑色素瘤的早期診斷和臨床診療提供了重要依據。

文章標題：Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma

期刊名稱(chēng)：Cancer Cell

影響因子：50.3

合作單位：北京大學(xué)第一醫院、北京大學(xué)-云南白藥國際醫學(xué)研究中心

研究方法：全外顯子組、基于顯微切割的多區域全外顯子測序、bulk轉錄組、單細胞轉錄組、空間轉錄組和CODEX空間蛋白組學(xué)

百邁客生物為該研究提供了BMKMANU S1000空間轉錄組細胞分割技術(shù)服務(wù)。

研究背景

肢端型黑色素瘤（acral melanoma, AM）是一種起源于手掌、足底和甲下等部位的惡性皮膚腫瘤，也是亞洲人群中最主要的黑色素瘤亞型，常發(fā)生轉移且預后不佳。原位AM（AM in situ, AMis）經(jīng)手術(shù)切除后極少復發(fā)，但侵襲性AM（invasive AM, iAM）的預后不佳，且PD-1單抗治療響應率僅約20%-30%，缺乏有效的治療策略。因此，AMis突破基底膜進(jìn)入真皮發(fā)展為iAM是造成患者預后變差的重要里程碑事件。然而，目前關(guān)于A(yíng)Mis的研究仍然十分有限，AMis向iAM的演化過(guò)程尚不清楚，免疫微環(huán)境在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用也不明確。AM的早期發(fā)現和預防可以顯著(zhù)提高病人預后和治療。

材料方法

研究材料：

287例肢端型黑色素瘤（AM）患者，146例原位AM（AMis）和141例侵襲性AM（iAM），其中測序隊列（147例，其中56例AMis和91例iAM）和驗證隊列（140例，驗證所鑒定出的標志物和臨床相關(guān)性）。

驗證實(shí)驗：流式分選巨噬細胞（AM患者腫瘤組織和配對外周血，n=4）；健康供體外周血單核細胞和 LM-MEL-45腫瘤細胞系C.M.共培養（0、3、5、7、10、14天，n=3）；流式分選C3患者和非C3患者EMT腫瘤細胞（n=4）；APOE⁺/CD163⁺巨噬細胞和腫瘤細胞共培養體系（n=3）；LM-MEL-45腫瘤細胞系：野生型和IGF1R KO，IGF1抑制劑處理（xentuzumab），IGF1R抑制劑處理（linsitinib）

研究方法：

全外顯子組測序（n=92）、基于顯微切割的多區域全外顯子測序（n=33）、bulk轉錄組（n=81）、單細胞轉錄組（scRNA-seq，n=24）、空間轉錄組（BMKMANU S1000，n=10）空間蛋白組學(xué)（CODEX，n=12）。

研究結果

1.研究隊列信息和基因組圖譜

為了探究肢端型黑色素瘤的演化規律及免疫微環(huán)境在其中的作用，研究人員建立了一個(gè)287例患者的隊列，包含146例AMis和141例iAM，為研究AMis到iAM的演化過(guò)程提供了豐富的資源。研究人員將所有患者分為測序隊列（147例）和驗證隊列（140例），測序隊列包括56個(gè)AMis患者和91個(gè)iAM患者。

對測序隊列進(jìn)行了多組學(xué)測序，包括全外顯子組、基于顯微切割的多區域全外顯子測序、bulk轉錄組、單細胞轉錄組、空間轉錄組和CODEX空間蛋白組學(xué)，而驗證隊列用于驗證所鑒定出的標志物的臨床相關(guān)性。

全外顯子組測序平均覆蓋度為313X，基因組圖譜顯示本研究隊列的腫瘤突變負荷（TMB）與以前的AM研究相比較，高于UM組，低于CM組。本研究數據驗證了之前報道22q11.21擴增與AM預后相關(guān)，說(shuō)明了本研究隊列的高質(zhì)量，能夠對AM侵襲進(jìn)行深入分析。

2.AMis和iAM的基因組比較確定了侵襲驅動(dòng)因素

為了確定AM垂直侵襲的驅動(dòng)機制，研究人員首先描繪了AMis和iAM的基因組圖譜，并系統比較了兩者的點(diǎn)突變、拷貝數變異、突變負荷、突變印記、亞克隆突變及基因組不穩定性。分析結果表明iAM的亞克隆突變比例和基因組不穩定性顯著(zhù)升高。這種高度的基因組不穩定性可能會(huì )加速腫瘤的發(fā)生并有助于獲得侵襲驅動(dòng)突變。

值得注意的是，研究人員發(fā)現驅動(dòng)突變（NRAS, KRAS, NF1, KIT）在iAM中顯著(zhù)富集，并在體外實(shí)驗中驗證了這些驅動(dòng)突變可以增強肢端型黑色素瘤的侵襲能力。這些結果表明AM侵襲高度依賴(lài)于獲得某些驅動(dòng)突變，而不是簡(jiǎn)單地積累更多的突變。

AMis和iAM的轉錄組學(xué)比較顯示在iAM中富集細胞外基質(zhì)(ECM)組織、EMT、KRAS、巨噬細胞遷移和干擾素γ (IFNγ)?通路，暗示AM侵襲期間TME失調?？偟膩?lái)說(shuō)，驅動(dòng)突變、基因組不穩定性和TME改變共同作用有助于A(yíng)M侵襲。另外，研究人員還發(fā)現附屬器受累也與AMis的驅動(dòng)突變及侵襲能力密切相關(guān)。

3.早期A(yíng)M的演化克隆過(guò)程

本文利用LCM技術(shù)探討患者內部垂直侵襲和區域擴張的進(jìn)化動(dòng)態(tài)。首先比較了AMis、Syn_AMis和Syn_iAM三種不同類(lèi)型病變的基因組圖譜，在5例表現出侵襲驅動(dòng)基因的患者中發(fā)現配對的Syn-AMis和Syn-iAM共有突變，但是在純AMis中沒(méi)有檢測到。這個(gè)結果表明在垂直侵襲之前就已經(jīng)獲得了侵襲驅動(dòng)突變，進(jìn)一步證實(shí)了它們在A(yíng)M侵襲中的驅動(dòng)作用，這些結果也證實(shí)之前提到的基因組不穩定性有助于A(yíng)M侵襲。進(jìn)一步探索垂直侵襲起源，研究結果表明，在垂直侵襲階段，AMis在演化早期獲得驅動(dòng)突變并迅速穿過(guò)基底膜，以單克隆播散到真皮中。

為了探究區域擴張的演化模式，通過(guò)腫瘤細胞分數?(CCF)推測其克隆組成分析發(fā)現不同患者中存在兩種不同的擴張模式：（1）CE，克隆擴張，即腫瘤細胞保持單一克隆結構進(jìn)行均質(zhì)擴張；（2）SD，亞克隆分化，即腫瘤細胞在增殖過(guò)程中獲得亞克隆，導致腫瘤異質(zhì)性升高。

4.多組學(xué)分析確定AM三種分子亞型

為了進(jìn)一步了解AM分子亞型，本文利用bulk RNA-seq對81名患者進(jìn)行檢測，確定C1、C2、C3三種分子亞型。C1亞型作為“角蛋白”亞型，C2亞型提示“染色質(zhì)重塑”表型，C3亞型表現出“增殖”表型。C3亞型亞克隆突變比例最高，且預后最差。其中C1和C2是均勻混合AMis和iAM，C3亞型高度富集iAM，表明iAM是一個(gè)獨特的子集。與非C3 iAM（C1和C2 iAM）相比較，C3 iAM表現為PFS縮短和明顯的惡性現象類(lèi)型，尤其值得注意的是C3 iAM表現出顯著(zhù)性更多的亞克隆突變。同時(shí)發(fā)現C3亞型表現出較高水平的免疫浸潤、腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)和EMT，而通過(guò)這三種AM分子亞型來(lái)看腫瘤負荷與TAM評分是相互獨立的。相比之下，TAM評分與基因組不穩定性相關(guān)，包括wGII和CNH-DNA評分以及亞克隆突變。此外, TAM評分與EMT評分相關(guān)和預后差。這些結果共同表明TAM的浸潤可能會(huì )促進(jìn)C3的腫瘤EMT和基因組不穩定性并導致預后不良。

5.scRNA-seq鑒定APOE⁺/CD163⁺巨噬細胞亞群

為了在單細胞水平研究腫瘤和TME細胞異質(zhì)性，利用單細胞轉錄組技術(shù)對8個(gè)AMis?和16個(gè)iAM進(jìn)行檢測，一共獲得223023個(gè)細胞，聚類(lèi)分為13個(gè)細胞群。并針對巨噬細胞進(jìn)行亞群分析，鑒定5種亞群，包括Mph_APOE_CD163，Mph_APOE, Mph_CD163， Mph_ISG15，和Mph_TIMP1。分析顯示Mph_APOE_CD163、Mph_CD163和Mph_APOE 均為免疫抑制TAM，因此統稱(chēng)為?APOE⁺/CD163⁺ TAM。研究發(fā)現這類(lèi)巨噬細胞在C3亞型中顯著(zhù)富集，且浸潤程度與腫瘤EMT分數正相關(guān)。配體-受體分析表明，巨噬細胞表現出最豐富的細胞間相互作用。

6.空間轉錄組學(xué)分析證實(shí)了APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細胞之間的直接接觸和密切相互作用

為了探索APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT高水平的腫瘤細胞相關(guān)作用，通過(guò)空間轉錄組測序技術(shù)（ST，BMKMANU S1000）檢測10個(gè)AM樣品。結果可清晰觀(guān)察到腫瘤組織多層結構，包括表皮層：基層、棘層和顆粒層、以及分泌汗腺的皮下結構和血管。在C3 iAM患者中，腫瘤區域富集大量的EMT高水平的腫瘤細胞，同時(shí)也高度浸潤了APOE⁺/CD163⁺ TAM，而在非C3患者中無(wú)法發(fā)現這種共存。正如預期的那樣，C3患者表現出EMT腫瘤細胞比例明顯較高，并且APOE⁺/CD163⁺ TAM水平增高。C3患者中，在空間位置上APOE⁺/CD163⁺ TAM更接近EMT腫瘤細胞。CellChat分析顯示APOE⁺/CD163⁺ TAM作為信號發(fā)送者(配體)和接收著(zhù)（受體）均表現出高活性，證實(shí)了其具有細胞與細胞強互作。與其他免疫細胞相比，APOE⁺/CD163⁺ TAM表現出最高水平的胰島素生長(cháng)因子(IGF)信號網(wǎng)絡(luò )的發(fā)送細胞和接收細胞，這些結果揭示APOE⁺/CD163⁺ TAM和EMT腫瘤細胞在空間上的直接接觸和密切相互作用。

文中如何在空間上實(shí)現單細胞分辨率EMT腫瘤細胞和非EMT腫瘤細胞的詳細注釋呢？

研究者利用高分辨空間轉錄組技術(shù)結合細胞分割方法定位到腫瘤EMT狀態(tài)的細胞被定義為EMT腫瘤細胞，而非EMT腫瘤細胞被映射到其他腫瘤狀態(tài)。

7.多重空間蛋白質(zhì)組學(xué)驗證了APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細胞之間的相互作用

進(jìn)一步驗證APOE⁺/CD163⁺?TAM和EMT腫瘤細胞在蛋白水平上的空間分布和相互作用，文中對12個(gè)AM樣本進(jìn)行了空間蛋白組檢測（22 plex CODEX）。其中C3患者以EMT腫瘤區域為主，非C3患者以非EMT腫瘤區域為主，結果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM與EMT腫瘤細胞呈正相關(guān)。在C3患者中，IGF1和IGF1R的表達水平均顯著(zhù)升高。APOE⁺/CD163⁺ TAM高度富集在EMT^high區域。同時(shí)IGF1和IGF1R在EMT^high區域也顯著(zhù)升高。這些結果在單細胞水平和空間水平均支持APOE⁺/CD163^+?TAM可能通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細胞的EMT。

8.實(shí)驗驗證APOE⁺/CD163⁺ TAM通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細胞的EMT

流式分選患者腫瘤組織和配對外周血APOE⁺/CD163⁺ TAM，蛋白水平可以檢測到APOE⁺/CD163⁺ TAM的表達，同時(shí)AM細胞可以誘導APOE⁺/CD163⁺ TAM表型。離體分析證實(shí)C3患者的EMT腫瘤細胞的比例明顯高于非C3患者，ELISA分析顯示，與APOE⁺/CD163⁺ TAM共培養后，IGF1蛋白的分泌持續升高，而IGF1抑制劑、IGF1R抑制劑及敲除腫瘤的IGF1R均可以抑制這一過(guò)程，這些結果表明APOE⁺/CD163⁺ TAM可以通過(guò)IGF1-IGF1R相互作用促進(jìn)腫瘤細胞的EMT。研究人員還在兩個(gè)獨立隊列中驗證了APOE和CD163染色可用于預測AM的預后。

研究總結

綜上所述，本研究基于多組學(xué)測序，系統揭示了早期肢端型黑色素瘤的克隆演化規律，建立了肢端型黑色素瘤的分子分型，解析了腫瘤細胞-免疫細胞的空間互作關(guān)系，鑒定出新的早期診斷標志物（驅動(dòng)突變和附屬器受累）及晚期預后標志物（APOE和CD163），為肢端型黑色素瘤的早期診斷和精準診療提供了重要信息。

北京大學(xué)第一醫院的張寧教授、李航教授和北京大學(xué)-云南白藥國際醫學(xué)研究中心的薛瑞棟研究員（北京大學(xué)第一醫院兼職教授）為共同通訊作者。北京大學(xué)-云南白藥國際醫學(xué)研究中心劉恒康博士后、北京大學(xué)第一醫院皮膚性病科高嘉雯博士和北京大學(xué)第一醫院腫瘤轉化研究中心馮梅博士后為共同第一作者。

參考文獻：

Liu et al., Integrative molecular and spatial analysis reveals evolutionary dynamics and tumor-immune interplay of?in situ?and invasive acral melanoma,?Cancer Cell?(2024), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.04.012

百創(chuàng )S3000?3.5μm?極致提升空間檢測深度和精度

基于空間組學(xué)快速發(fā)展，百邁客自主創(chuàng )新單細胞分辨率空間轉錄組技術(shù)（S1000、S2000、S3000），開(kāi)創(chuàng )原片無(wú)錯高清H&E+原片無(wú)錯熒光+原片測序，“三片合一”實(shí)現精準的細胞分割，將空間轉錄組推進(jìn)到真實(shí)單細胞分辨率的領(lǐng)域。

經(jīng)過(guò)不斷打磨，百創(chuàng )智造于2024年3月27日在山東青島正式發(fā)布了百創(chuàng )S3000空間轉錄組芯片，性能全面升級，極致提升空間組學(xué)檢測的深度和精度。

百創(chuàng )S3000在6.8mm*6.8mm 的捕獲區域內鋪設了4,144,770個(gè)捕獲位點(diǎn)，相鄰兩個(gè)捕獲位點(diǎn)的中心距為3.5μm。

相較于現在廣受市場(chǎng)認可與好評的百創(chuàng )S1000轉錄組芯片，捕獲位點(diǎn)數提升近2倍，分辨率同樣提升近2倍。

在相同的測序飽和度下，單細胞級別分辨率下中位UMI提升了30%~70%，中位基因數提升30%-60%。