CDD︱單細胞轉錄組測序技術(shù)助力魯明/胡剛團隊發(fā)表新成果

2024年11月，南京醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院藥理學(xué)系魯明教授、胡剛教授團隊在Cell Death & Differentiation發(fā)表題為”Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons”的研究論文，使用單細胞轉錄組測序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述小鼠硬腦膜免疫細胞的抗抑郁機制，為抑郁癥治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。接下來(lái)是本文的詳細解讀。

文章標題：Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons

期刊名稱(chēng)：?Cell Death & Differentiation

影響因子：13.7

合作單位：南京醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院藥理學(xué)系

研究對象：小鼠

百邁客生物為該研究提供了10X單細胞轉錄組測序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神障礙，表現為長(cháng)時(shí)間情緒低落、失去快樂(lè )或對活動(dòng)的興趣等，其表現不同于正常的情緒變化和對日常生活的感覺(jué)。抑郁癥具有發(fā)病率高、臨床治愈率也高，但治療接受率低、復發(fā)率高的特征，目前治療手段有限，約有30%患者接受一線(xiàn)抗抑郁藥物后癥狀無(wú)緩解，癥狀有緩解的部分患者會(huì )在首次治療后復發(fā)。因此，有必要深入研究認識抑郁癥的生理病理致病機制，為開(kāi)發(fā)更有效的治療手段提供見(jiàn)解。

材料及方法

材料：8周大C57BL/6雄性小鼠以及6個(gè)月大ICR小鼠，構建慢性社交挫敗應激（CSDS）模型。不同基因型小鼠（Il33-/-，Il1rl1-/-，Rag1-/-，Foxp3DTR）購買(mǎi)后，培養1周后再進(jìn)行實(shí)驗。

方法：單細胞轉錄組測序，免疫熒光，RT-PCR，ELISA，Western blot，流式細胞術(shù)，細胞實(shí)驗，動(dòng)物實(shí)驗等。

研究結果

• 抑郁應激誘導小鼠出現顯著(zhù)的硬腦膜Treg擴增

研究者首先構建CSDS小鼠模型并經(jīng)過(guò)行為學(xué)實(shí)驗驗證，采用流式細胞術(shù)等研究CSDS小鼠硬腦膜-腦界面免疫細胞，發(fā)現Treg（調節性T細胞）在硬腦膜而不是腦實(shí)質(zhì)中顯著(zhù)增殖激活，fluoxetine（抗抑郁藥物）顯著(zhù)激活硬腦膜Treg擴增，這些結果暗示Treg可能在抑郁樣行為發(fā)展中起到重要作用，fluoxetine可能通過(guò)增加硬腦膜中的Treg減輕抑郁表現，調控硬腦膜Treg或許是治療抑郁的潛在靶點(diǎn)。

• 定義硬腦膜Treg免疫表型

CSDS小鼠和對照組小鼠硬腦膜分選得到的免疫細胞進(jìn)行scRNA-seq，結果顯示CSDS小鼠硬腦膜T細胞占比增加，其中Treg和Th17比例增加，Th2比例降低，初始T細胞沒(méi)有發(fā)生變化；Treg中，Gata3+?Treg比例提高，初始Treg和Rorx+?Treg比例降低。對照組小鼠硬腦膜和脾臟分選得到Treg進(jìn)行SMART-seq，發(fā)現與脾臟相比，硬腦膜Treg的Gata3+亞型和Rora+亞型相關(guān)基因表達上調。流式細胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CSDS小鼠硬腦膜中GATA3+?Treg顯著(zhù)增加，RORγt+?Treg數量無(wú)顯著(zhù)變化。這些表明GATA3+ Treg可能參與抑郁表現的調控。

• IL33/ST2信號參與CSDS應激后硬腦膜中Treg增加

SMART-seq數據顯示CSDS小鼠硬腦膜“IL33結合”以及其他內源性分子結合信號通路表達上調；與脾臟相比，CSDS小鼠硬腦膜中表達ST2的細胞比例顯著(zhù)高于脾臟；硬腦膜Treg富集趨化性通路。scRNA-seq數據也顯示CSDS小鼠模型中T淋巴細胞聚群高表達ST2編碼基因，且表達水平高于對照組小鼠的T淋巴細胞；CSDS小鼠模型硬腦膜Treg高表達ST2編碼基因。隨后，研究者將WT小鼠和Il1rl1-/-小鼠硬腦膜Treg細胞轉移到Rag1-/-小鼠并構建CSDS模型，行為學(xué)等實(shí)驗結果證實(shí)，ST2表達是硬腦膜Treg招募和擴張所必須的。IL33-/-小鼠相關(guān)實(shí)驗也支持了IL33/ST2信號在抑郁期間促進(jìn)硬腦膜Treg增殖。

• mPFC星形細胞IL33介導了硬腦膜Treg的浸潤

mPFC、海馬、腦脊液等組織的ELISA、qPCR以及Western blot實(shí)驗結果表明，CSDS小鼠硬腦膜ST2+ Treg激活所需的IL33來(lái)源于腦實(shí)質(zhì)而不是硬腦膜。多重免疫熒光結果表明mPFC處星形細胞是IL33增加的主要貢獻細胞類(lèi)型。進(jìn)一步的特異性細胞類(lèi)型IL33基因表達KO-恢復實(shí)驗及相應的行為學(xué)實(shí)驗、流式細胞術(shù)等結果表明，主要是星形細胞來(lái)源的IL33介導了CSDS小鼠中硬腦膜Treg的產(chǎn)生。

• 通過(guò)增強AREG分泌，硬腦膜Treg抵消了抑郁應激

進(jìn)一步分析scRNA-seq數據發(fā)現T細胞簇還顯著(zhù)高表達Areg，流式細胞術(shù)、Western blot、免疫熒光等實(shí)驗表明CSDS小鼠硬腦膜AREG分泌加強，mPFC區域AREG表達水平顯著(zhù)降低。通過(guò)向CSDS應激小鼠腦延髓注釋AREG的中和抗體并進(jìn)行檢測，發(fā)現CSDS小鼠表現出更嚴重的抑郁行為。這些結果暗示來(lái)源于硬腦膜Treg的AREG可能是抑郁進(jìn)展中的主要中間物。

• 硬腦膜Treg來(lái)源的AREG可以影響CSDS小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元

腦免疫熒光掃描結果表明硬腦膜來(lái)源的AREG可能特異性的影響mPFC神經(jīng)元活性，TSA多重染色等實(shí)驗結果表明，CSDS應激顯著(zhù)誘導mPFC神經(jīng)元EGFR（AREG是EGFR配體）的表達，硬腦膜AREG去除可顯著(zhù)抑制mPFC的EGFR激活，小腦延髓池注射的AREG中和抗體只去除了硬腦膜AREG但對mPFC腦區AREG無(wú)顯著(zhù)影響。通過(guò)這些結果，研究者假設神經(jīng)元表達EGFR可以接收硬腦膜Treg來(lái)源的AREG，并激活EGFR信號，直接影響神經(jīng)元活性。

為了驗證這一假設，研究者使用AAV抑制mPFC錐體神經(jīng)元EGFR的表達，免疫熒光、Western blot等實(shí)驗結果表明，敲除EGFR部分地加重CSDS小鼠抑郁表現，應激誘導的抑郁中mPFC神經(jīng)元EGFR信號起到重要作用，揭示mPFC錐體神經(jīng)元是硬腦膜Treg來(lái)源AREG的靶細胞。

隨后研究者使用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄CSDS小鼠mPFC錐體神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流（mEPSC），發(fā)現20ng/ml AREG條件下，錐體神經(jīng)元的mEPSC振幅顯著(zhù)降低但頻率沒(méi)有變化，表明AREG可抑制AMPA受體功能，降低突觸后位點(diǎn)數量，進(jìn)一步降低EGFR+ 錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞。

綜上，研究者推測硬抑郁小鼠腦膜Treg來(lái)源的AREG可以通過(guò)抑制mPFC錐體神經(jīng)元的過(guò)度興奮，抵抗抑郁表現。

研究總結

本研究發(fā)現硬腦膜Treg在神經(jīng)響應抑郁刺激中起到重要作用，硬腦膜Treg與mPFC神經(jīng)細胞通過(guò)AREG-EGFR交流，調控抑郁進(jìn)展。該發(fā)現表明硬腦膜Treg可作為減輕抑郁表型的靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新型診療手段提供了不同思路。