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2024年7月，中國醫科大學(xué)盛京醫院在國際學(xué)術(shù)期刊cell proliferation發(fā)表一項重要研究成果，題為：Rack1‐mediated ferroptosis affects hindgut development in rats with anorectal malformations: Spatial transcriptome insights。使用空間轉錄組測序、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測等來(lái)剖析直腸肛門(mén)畸形的發(fā)育機制。

期刊名稱(chēng)：cell proliferation.

影響因子：5.9

合作單位：中國醫科大學(xué)盛京醫院

研究部位：大鼠胚胎

研究方法：空間轉錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測等

百邁客生物為該研究提供了空間轉錄組測序服務(wù)。

研究背景

肛門(mén)直腸畸形 （ARM） 是兒童常見(jiàn)的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。最近的研究強調了遺傳調控在這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術(shù)干預作為治療。然而，ARM 患者的長(cháng)期術(shù)后結局并不理想，通常會(huì )導致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對受影響兒童的生活質(zhì)量和社會(huì )心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉錄組學(xué)分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴(lài)性的程序性細胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物在 ARM 后腸內積累。作者假設這個(gè)過(guò)程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調節，細胞質(zhì)蛋白與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結合蛋白有相似之處。它在細胞生長(cháng)、分化、信號傳導和免疫反應中發(fā)揮著(zhù)多種作用，并且在胚胎神經(jīng)發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒(méi)有報道 Rack1 在鐵死亡調節中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進(jìn)一步探索。

材料方法

使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開(kāi)始口服 1% ETU 125 mL/kg，對照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。

1、空間轉錄組測序剖宮產(chǎn)后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預冷OCT的包埋盒中儲存在 -80°C 冰箱中。共計6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光

選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進(jìn)行染色。

研究結果

1.空間轉錄組測序的注釋聚類(lèi)

在這項研究中，作者在 GDs 14-16 （稱(chēng)為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱(chēng)為 A14-16） 上使用 ETU 誘導的 ARM 胚胎進(jìn)行空間轉錄組測序。制備大鼠胚胎的 6 個(gè)冷凍中矢狀切片，每個(gè) 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時(shí)間點(diǎn)泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉錄組技術(shù)，然后進(jìn)行組織透化、cDNA 合成和文庫構建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺(jué)基因轉錄數據，主要來(lái)自泄殖腔區域。為了確保來(lái)自同一區域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進(jìn)行了聚類(lèi)注釋?zhuān)a(chǎn)生了七個(gè)不同的聚類(lèi)。這些集群包括泄殖腔區域內的五個(gè)特定區域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結節。此外，兩個(gè)簇 （簇 5 和 6） 對應于椎體和神經(jīng)管區域 （圖 1A）。平均而言，每個(gè)解剖區域覆蓋 3005 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)捕獲 16,905 個(gè)基因（圖 1B）。

 

2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選

鑒定 DEG 的標準被確定為絕對對數2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著(zhù)性水平為 p< 0.05. 這種篩選導致了差異火山圖的創(chuàng )建，以說(shuō)明基因表達的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個(gè)基因，它們在這些時(shí)間點(diǎn)表現出不同的表達譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內的表達降低。為了進(jìn)一步探索潛在的分子相互作用，作者進(jìn)行了全面的 PPI 分析。通過(guò)利用 BC 值作為排名標準，作者突出了最顯著(zhù)的差異表達后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節點(diǎn)表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個(gè)基因在基因網(wǎng)絡(luò )中都具有顯著(zhù)的中心性。值得注意的是，Rack1 表現出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網(wǎng)絡(luò )中躋身前五名基因之列。

3.在 GD 15 上驗證后腸部分 DEGs

圖 2A-E 全面說(shuō)明了 GD15 截面泄殖腔區域中前五個(gè)基因的蛋白質(zhì)表達模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質(zhì)在 N15 泄殖腔區域的尿道和后腸上皮內均表現出位點(diǎn)特異性表達。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區域內表現出表達水平升高。此外，觀(guān)察到這些蛋白質(zhì)離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質(zhì)附近。相比之下，這五種蛋白的表達在 A15 泄殖腔區域的尿道和后腸上皮內明顯下降，伴隨著(zhù)尿道直瘺部位的表達水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評估，特別是在后腸結構域內。

4.PROGENy 算法預測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集

PROGENy 算法用于通過(guò)下游基因表達的變化評估信號通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評分。在使用 NNMF 對后腸區域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進(jìn)行聚類(lèi)分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號通路呈強正相關(guān)，表明 MAPK 信號在后腸中顯著(zhù)富集（圖 3A)。從這些區域提取來(lái)自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個(gè)成員分子的定位表達模式。具體來(lái)說(shuō)，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區域。這些蛋白質(zhì)的免疫熒光驗證證實(shí)了它們在尿道和后腸區域的特異性表達，在 URS 和間質(zhì)區域的表達相對較弱，這與 PROGENy 預測一致（圖 3B）。

5.通過(guò)細胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達模式

在基因集富集分析（GSEA）數據庫中，細胞死亡基因集包含161個(gè)基因，其中 7 個(gè)細胞死亡相關(guān)基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類(lèi)1的6個(gè)樣本相同區域內的細胞死亡基因的表達譜。值得注意的是，發(fā)現谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族的關(guān)鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區域的顯著(zhù)定位，在 URS 中觀(guān)察到的分布相對較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀(guān)察到 Gpx4 陽(yáng)性信號的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達在統計學(xué)上顯著(zhù)降低（p < 0.05;圖 4D）。

6.PD-L2 過(guò)表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進(jìn)對 EGFR-TKI 的耐藥

N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內共定位。該結果表明 Rack1 在調節這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進(jìn)行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細胞線(xiàn)粒體體積減小，線(xiàn)粒體密度增加，線(xiàn)粒體嵴減少。這些觀(guān)察結果與與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的線(xiàn)粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。

7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達譜

之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區的定位（圖 2A），作者進(jìn)一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽(yáng)性信號主要在尿道和后腸的上皮細胞中觀(guān)察到，后腸遠端的濃度較高。這些信號也分散在 URS 和間充質(zhì)細胞內。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀(guān)察到 Rack1 陽(yáng)性細胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽(yáng)性信號的 AOD 沒(méi)有顯著(zhù)差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周?chē)g充質(zhì)區域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區域的熒光強度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說(shuō)明了后腸區域的半定量 AOD 結果。

8.敲低 Rack1 誘導腸上皮細胞鐵死亡

在 IEC-6 細胞中轉染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀(guān)察細胞超微結構。si-Rack1 組表現出完整的細胞和核膜，線(xiàn)粒體大小減小，線(xiàn)粒體密度增加。此外，線(xiàn)粒體嵴減少或不存在，類(lèi)似于 erastin 處理后觀(guān)察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測定中觀(guān)察到的 Rack1 敲低導致細胞活力降低，LDH 測定所示，細胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細胞內亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測量細胞內 ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質(zhì)過(guò)氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強度定量結果如右圖所示。

9.Rack1 敲低可增強 P38 磷酸化并調節下游 Nqo1/Gpx4 表達

如前所述，MAPK 信號通路在后腸區域顯著(zhù)富集（圖 3A）。在 IEC-6 細胞中轉染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀(guān)察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統計學(xué)顯著(zhù)升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對 Rack1 的干擾增強了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細胞中的 P38-MAPK 信號通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個(gè)基因（圖 6E）。此外，這 7 個(gè)基因的表達豐度數據與現有研究報告相結合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進(jìn)一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉了 Rack1 敲除誘導的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀(guān)察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過(guò) 2-HBA 處理恢復（圖 6G）。

10.Rack1?通過(guò) P38 和 Nqo1 介導腸上皮細胞中的鐵死亡

在 IEC-6 細胞敲低 Rack1 的同時(shí)，使用 doramapimod 和 2-HBA 進(jìn)行拯救實(shí)驗。結果顯示，與單獨的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導致細胞活力增加和相對 LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細胞內亞鐵離子濃度降低，同時(shí) ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現表明，Rack1 通過(guò)P38信號通路和 Nqo1 調節細胞內鐵含量和脂質(zhì)過(guò)氧化，從而介導腸上皮細胞的鐵死亡。

研究總結

本研究利用空間轉錄組學(xué)技術(shù)對 GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進(jìn)行測序。作者在后腸區域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀(guān)察到 MAPK 信號通路的顯著(zhù)富集和 Gpx4 在后腸區域的差異表達。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達降低，通過(guò) P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細胞內鐵、ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化水平，最終誘導腸上皮細胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現增強了作者對 ARM 發(fā)病機制的理解，并對推進(jìn) ARM 產(chǎn)前診斷和治療策略的研究具有重要意義。