PCR（polymerase chain reaction）擴增目的片段→電泳（electrophoresis）→純化（purification）→連接 (ligase )→轉化(transformation)→陽(yáng)性克隆(positive clone)→檢測(detection)
圖1：無(wú)縫克隆流程圖（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )）
2. PCR擴增：選擇要擴增的目的片段，在正義鏈和反義鏈的末端分別設計一條帶有線(xiàn)性化載體正義鏈和反義鏈部分同源序列一致的引物，此處參考說(shuō)明書(shū)建議（15-25bp）。為了減少非特異性擴增，建議與靶序列的匹配度越高越好。
3.電泳：PCR結果的好壞通常通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀(guān)察條帶有無(wú)或者濃度大小，基本原理是瓊脂糖凝膠介質(zhì)中添加了在紫外下可以顯色的EB, 這種試劑可以嵌合到核酸分子中，與DNA雙鏈結合，因此，分子量越大的DNA分子，顯色度越高，在相同濃度下也越亮。有的時(shí)候如果分子量很小的DNA, 濃度又不高的情況下，DNA條帶有可能會(huì )出現假陰性的結果。
4.目的片段的純化（膠回收）：PCR擴增結束后，體系中可能會(huì )有未參與反應的聚合酶，Mg2+等，所以一般是建議通過(guò)純化的步驟將這些雜質(zhì)去除，以利于后續反應的穩定進(jìn)行。
載體線(xiàn)性化：目的片段插入需要將環(huán)狀的質(zhì)粒用酶來(lái)消化成線(xiàn)性的雙鏈DNA分子，實(shí)際情況下載體消化會(huì )因為反應時(shí)間和酶量多少而有較大區別，如果用于后續的基因克隆，建議消化盡量完全。
5.連接反應：Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix試劑盒可以將多個(gè)片段組合到載體上，形成一個(gè)環(huán)狀的重組質(zhì)粒。用于后續的建庫測序或者誘導蛋白表達。
6.轉化：基本原理是質(zhì)粒容易在大腸桿菌中穩定繁殖，這部分是基因克隆的關(guān)鍵，如果成功，后續的平板上會(huì )有單克隆的出現。有單克隆出現可以進(jìn)行下一步實(shí)驗。單克隆平板可以在4 ℃冰箱存放一個(gè)月，仍然不失效。
7.檢測：挑取帶有抗生素平板單克隆擴大培養，3-4 h, 使質(zhì)?？截悢翟黾?，隨后用于菌落PCR檢測，是否是插入了目標片段的質(zhì)粒。
小貼士
其他判斷陽(yáng)性單克隆的方法？
最可靠的方法是酶切，一個(gè)環(huán)狀重組質(zhì)粒，在對應的位置用限制性?xún)惹忻鸽p酶切后，會(huì )出現兩個(gè)目的片段，如果不能出現兩個(gè)片段，一般可以認為是空載體沒(méi)有線(xiàn)性消化完全。
結果展示
圖2：?jiǎn)慰寺z測示意圖
結果分析
攜帶有目的片段的質(zhì)粒能夠抵抗抗生素，才使得在平板培養基上長(cháng)出來(lái)。但也有可能是沒(méi)有消化完全的空質(zhì)粒。因此，下一步的鑒定實(shí)驗顯得尤為重要。菌落PCR在分子生物學(xué)實(shí)驗中，容易有假陽(yáng)性出現，可能的原因很多，因此，最根本的方法就是提高陽(yáng)性率。以質(zhì)粒為模板擴增，產(chǎn)物濃度會(huì )很高，可作為判定假陽(yáng)性的一個(gè)依據。以及上述所提及的質(zhì)粒的酶切，都是最常用的方法。
保存條件
產(chǎn)品應用
DNA定點(diǎn)突變
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