PCR(Polymerase chain reaction)即聚合酶鏈式反應，是一種體外擴增基因的技術(shù)或獲得目的基因片段的方法。在分子生物學(xué)實(shí)驗中已占有及其重要的地位。隨著(zhù)越來(lái)越多的基因研究，PCR已走進(jìn)了實(shí)驗人的千家萬(wàn)戶(hù)。請讀者跟著(zhù)小編的步伐，揭開(kāi)PCR的神秘面紗！
不少初入基因克隆的新手來(lái)說(shuō)，PCR實(shí)驗結果常常不理想，別急，根據小編的經(jīng)驗，總結了大概有以下幾點(diǎn)的原因，或許會(huì )幫助屏幕前的你走出誤區：
PCR擴增無(wú)目的條帶
這種結果的出現是所有失敗里面出現次數多的情況，比較好的方法就是嘗試更換引物，如果不是以下原因出現的話(huà)，引物的好壞決定了PCR實(shí)驗的成敗。通常情況下，引物擴增效率高的話(huà)，即便溫差在5度，都可以獲得很理想的結果，且特異擴增。一般選擇引物GC含量在40%-60%，堿基數在19-23bp即可。GC含量高，可以減少堿基的數量，含量少，可以增加堿基的數量。
PCR出現非特異擴增
這種情況的出現一般都是引物的特異性較差，或者也有可能是模板濃度太高，致使模板鏈數量太多，引物極易錯誤配對，此時(shí)可適當稀釋模板，應該會(huì )有很好的效果，但還有一種極其特殊的情況，就是出現了污染。
常見(jiàn)污染來(lái)源：
1：槍桿的污染，這是實(shí)驗室最常見(jiàn)的污染，由于上次吸液動(dòng)作劇烈，移液時(shí)會(huì )把上次污染源帶入到實(shí)驗中，而PCR最容易受到微量液體的污染，導致實(shí)驗失敗。
2：手套等外源核酸酶的污染，以及PCR體系的水一定選擇滅菌水。
PCR條帶弱
有目的條帶，但是濃度低，引物如果沒(méi)有問(wèn)題的話(huà)，那就是模板講解的原因。根據實(shí)驗室經(jīng)驗表明，模板最多不凍融超過(guò)兩次，四度溶解后保存不能超過(guò)一個(gè)星期，其實(shí)一個(gè)星期之內，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)，條帶會(huì )逐漸減弱，七天之后就沒(méi)有了，所以模板的保存很重要。
巢式PCR（nested PCR）
巢式PCR就是利用PCR擴增的產(chǎn)物當模板，在目的基因片段內再設計一對嵌套引物，作為巢式PCR引物，此時(shí)經(jīng)過(guò)幾輪PCR后，目的擴增產(chǎn)物的濃度就會(huì )很高，但同時(shí)也會(huì )引入一些堿基突變。適用于基因表達量低的基因克隆或者提高目的片段的濃度，會(huì )有不錯的效果。
半巢式PCR, 利用一個(gè)嵌套引物，而不是一對，原理同巢式PCR相似，都會(huì )使目的片段增亮幾個(gè)級別。
圖1 原始PCR產(chǎn)物
圖2 半巢式PCR產(chǎn)物
小編在做基因克隆時(shí)，如果要對圖1PCR產(chǎn)物送去測序，濃度會(huì )很低，達不到測序的濃度，當時(shí)就利用半巢式PCR, 經(jīng)過(guò)切膠，成功獲得了目的片段序列。
產(chǎn)物保存
盡量不要在4度超過(guò)一天，DNA很容易降解，保存時(shí)間太長(cháng)的話(huà)會(huì )對實(shí)驗結果產(chǎn)生一定的影響，超過(guò)兩天很有可能就會(huì )使條帶消失。建議直接膠回收并進(jìn)行后續實(shí)驗。
在此，給大家介紹一款百邁客生物公司的 PCR Mix試劑盒–Biomarker HS 2X HF Master Mix，該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：
高特異性
該試劑盒中的DNA聚合酶添加了能夠抑制酶活性的單克隆抗體，可進(jìn)行高特異性的熱啟動(dòng)PCR。
高保真性
該酶是具備高保真度的熱穩定DNA聚合酶之一，其保真度比Pyrococcus furiosus DNA聚合酶高6倍。
平末端擴增產(chǎn)物
該酶具和3′-5’和有5′-3’持續合成活性酸外切酶活性，其擴增產(chǎn)物為平末端。
操作簡(jiǎn)單
該預混液中僅需加入DNA 模板、引物和水即可進(jìn)行擴增。
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