上篇文章介紹了高通量測序后的實(shí)驗驗證手段，主要介紹了表達量驗證、RNA結合蛋白、亞細胞定位。本文從功能方面來(lái)對轉錄組測序的結果進(jìn)行驗證，功能方面無(wú)非就是使感興趣的基因的表達升高（功能獲得）或降低（功能缺失）看樣品表型是否有變化?；蜻^(guò)表達和基因沉默是研究基因功能的兩個(gè)重要手段。
功能獲得研究
功能獲得：過(guò)表達基因
構建克隆，將目的基因連接在特定的載體（可以是慢病毒載體、腺病毒載體、質(zhì)粒）上,在載體上一般含有增強基因轉錄的promoter。將克隆導入表達細胞中，即轉化或轉染（如果是昆蟲(chóng)表達系統,構建的質(zhì)粒還需要先轉座成為桿狀病毒基因組才能用于轉染）。轉染進(jìn)入細胞內的外源基因在其上游強啟動(dòng)子的作用下可以直接過(guò)量表達。
功能缺失研究
功能缺失：敲除、敲減、沉默基因表達
常用的沉默基因表達方法有，RNA干擾、CCRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點(diǎn)反轉和啟動(dòng)子缺失等方法?？筛鶕信d趣RNA的亞細胞定位選擇合適的敲減方法，如RNA干擾作用只作用在胞漿（胞漿+細胞器=胞質(zhì)）內，無(wú)法對細胞核起作用，此時(shí)siRNA或者shRNA方法可能不適用，需要用其他方式進(jìn)行基因沉默。
反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide）是指進(jìn)行了某些化學(xué)修飾的短鏈核酸（約15-25個(gè)核苷酸組成），其堿基順序排列與特定的靶標RNA序列互補，進(jìn)入細胞后可按照Watson-Crick堿基互補配對的原則與靶標序列形成雙鏈結構。反義寡核苷酸與靶標RNA結合后可抑制靶標RNA的表達。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA，與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA)導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應的基因沉默的現象。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱(chēng)為RNAi。
RNAi的實(shí)現有兩種方式，一種是直接購買(mǎi)siRNA寡核苷酸片段，轉染到靶細胞中；另一種是利用shRNA慢病毒載體構建穩轉的細胞系，shRNA在細胞中被加工為siRNA，進(jìn)而發(fā)揮RNAi的作用。
CCRISPR/Cas9是一種由RNA指導的，利用Cas9核酸酶對靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù)。該技術(shù)可方便快捷對任意基因進(jìn)行編輯改造，比如基因敲除，敲入，定點(diǎn)突變等，不過(guò)卻有相當的脫靶概率
從哪些方面可以看到基因表達的變化對表型造成變化呢，一般都是由淺入深，由細胞模型到動(dòng)物模型！有了這種驗證，想發(fā)低分文章都不能夠！
細胞實(shí)驗
通過(guò)改變該基因在細胞內的表達，來(lái)探討細胞表型是否會(huì )發(fā)生改變。如細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、遷移侵襲、細胞粘度、耐藥，還有難一點(diǎn)的血管形成、能量代謝等。
細胞表型的改變通常進(jìn)行正反兩種實(shí)驗，如敲除某基因驗證細胞凋亡時(shí)，做TUNEL實(shí)驗驗證其凋亡后，還需Rescue實(shí)驗將敲除基因重新導入細胞看是否能挽救表型。
細胞增殖
CCK-8/CFSE流式法、克隆形成實(shí)驗、MTT檢測細胞增殖
細胞凋亡
流式細胞術(shù)、Tunel法、Annexin V/PI雙染法，以及細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測（光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀(guān)察細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變）
細胞遷移和侵襲
Transwell
如果用matrigel膠包被transwell小室可以檢測腫瘤細胞的侵襲能力（invasion）；反之，不包被transwell小室檢測腫瘤細胞的遷移能力（migration）。
是不是看不懂，沒(méi)事，多看看文獻，做的時(shí)候自然就懂啦……
動(dòng)物實(shí)驗
通過(guò)改變關(guān)注基因在動(dòng)物內的表達，來(lái)探討動(dòng)物的表型是否會(huì )發(fā)生改變。因此，構建模擬人類(lèi)疾病表型的動(dòng)物模型至關(guān)重要。
醫學(xué)動(dòng)物模型
- 誘發(fā)性動(dòng)物疾病模型
人為地誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生類(lèi)似人類(lèi)疾病模型
- 自發(fā)性動(dòng)物模型
不加任何人工誘發(fā)，自然條件下自然產(chǎn)生疾病的動(dòng)物。
- 抗疾病型動(dòng)物模型
即特定的疾病不會(huì )在某種動(dòng)物發(fā)生，可研究天然抗性的因素。
- 生物醫學(xué)動(dòng)物模型
動(dòng)物正常的生物學(xué)特征來(lái)提供人類(lèi)疾病相似表型的疾病模型。
常見(jiàn)腫瘤模型
- 自發(fā)瘤模型
未經(jīng)任何有意識的人工處理，自然形成腫瘤
- 誘發(fā)瘤模型
利用外源性致癌物引起細胞遺傳特性改變，從而出現異常生長(cháng)活性細胞，形成腫瘤。常用實(shí)驗動(dòng)物為大鼠，也有用小鼠、豚鼠、兔、犬等。
- 移植瘤模型
將動(dòng)物或人體腫瘤細胞/組織移植到動(dòng)物體內連續傳代而形成腫瘤。腫瘤研究中最常用的是裸鼠模型，即建立皮下移植瘤模型（將腫瘤細胞或腫瘤組織直接種植在小鼠的皮下）。
注：不易成瘤的腫瘤組織一般選擇腫瘤腎被膜下種植移植瘤模型
- 基因組修飾模型
通過(guò)在動(dòng)物整體敲除或插入特性的基因而建立的腫瘤模型。
采用所研究的疾病/性狀對應的動(dòng)物模型，對動(dòng)物模型采用上述技術(shù)對特定基因進(jìn)行過(guò)表達或沉默處理，接下來(lái)去檢測相應的指標。如采用NB技術(shù)檢測相應基因的表達、腫瘤相應的生長(cháng)曲線(xiàn)、HE檢測組織的形態(tài)變化等。
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