中文名:斑馬魚(yú)的生物鐘通過(guò)核激素受體Nr1d1直接調控細胞自噬,通過(guò)Cebpb間接調控細胞自噬
英文名:The circadian clock regulates autophagy directly through the nuclear hormone receptor Nr1d1/Rev-erbα and indirectly via Cebpb/(C/ebpβ) in zebrafish
雜志:Autophagy,2016
影響因子:9.108
研究背景
細胞自噬是一種非常保守的細胞內降解系統,近期的研究表明小鼠中細胞自噬現象表現出了生物鐘節律,nr1d1基因缺陷能導致小鼠骨骼肌中自噬活動(dòng)的紊亂。然而生物鐘調節細胞自噬的機理還不清楚。斑馬魚(yú)的細胞自噬活動(dòng)是否表現出生物鐘節律還沒(méi)有報道,本研究旨在以斑馬魚(yú)為實(shí)驗材料研究nr1d1基因在調節細胞自噬的生物鐘節律方面的作用。
實(shí)驗設計
實(shí)驗材料:2種材料:野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚(yú)
2個(gè)時(shí)間點(diǎn):CT2和CT14(分別為受精后122和134小時(shí));
無(wú)生物學(xué)重復
測序方法:百邁客Illumina HiSeq2000 PE125
結果展示
1.表型描述及關(guān)鍵基因在幼魚(yú)和肝臟中的表達情況
首先用TEM(透射電鏡)對一天內不同時(shí)間(ZT0,ZT6,ZT12,ZT18)的肝臟切片進(jìn)行觀(guān)察,統計一天內自噬體數量的變化(紅色箭頭處,圖1,A),并進(jìn)行統計(圖1,B),研究表明斑馬魚(yú)肝臟內自噬體的數量符合生物鐘節律。
TEM觀(guān)測及自噬體數量統計結果
選取了幾個(gè)以前研究過(guò)的與自噬體形成、移動(dòng)、延伸、融合、降解有關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR分析,如maplc3b,bnip3,becn1等。材料為受精后72-96小時(shí)的斑馬魚(yú)幼體和肝臟材料。由圖可見(jiàn)這些基因都表現出明顯的生物鐘節律。圖中白色底色表示白天,灰色底色表示黑夜。
圖2 關(guān)鍵基因的RT-PCR檢測
2.用TALEN技術(shù)構建nrid1突變斑馬魚(yú),并進(jìn)行表型研究和關(guān)鍵基因表達分析
用TEM觀(guān)察WT和nr1d1突變斑馬魚(yú)肝臟中的自噬體數量,研究表明自噬體數量在nr1d1中明顯高于WT。
圖3 不同樣品斑馬魚(yú)肝臟自噬體觀(guān)測及統計
用RT-PCR研究在WT和nr1d1突變斑馬魚(yú)中關(guān)鍵基因的表達差異,nr1d1突變體中基因表達模式與WT中明顯不同。
圖4 差異基因的RT-PCR驗證
3.用ChIP和熒光素酶研究Nr1d1直接調控的下游基因
體外熒光素酶實(shí)驗表明Nr1d1蛋白能直接結合ulk1a基因的promoter區域,體內ChIP實(shí)驗進(jìn)一步證明Nr1d1蛋白能夠結合ulk1a基因的promoter區域。說(shuō)明Nr1d1能直接調控ulk1a基因的表達。
圖5 熒光素和chip結果
4. 野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚(yú)轉錄組分析
為了進(jìn)一步說(shuō)明nr1d1基因的功能,文章選取了野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚(yú)進(jìn)行轉錄組研究,并且取了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CT2和CT14)。研究表明在CT2階段兩者有975個(gè)差異表達基因,在CT14階段有1360個(gè)差異表達基因。與WT相比,在nr1d1突變體中上調的基因數量要大于下調的基因數量。
同時(shí),選取部分關(guān)鍵的差異表達基因進(jìn)行RT-PCR驗證,結果與轉錄組分析結果一致。
圖6 差異基因韋恩圖
圖7 差異基因聚類(lèi)圖
圖8 關(guān)鍵基因的RT-PCR驗證
研究結論
通過(guò)研究WT野生型和nr1d1突變型斑馬魚(yú)的基因表達情況,表明Nr1d1基因在生物鐘調節和細胞自噬過(guò)程中起著(zhù)重要作用。生物鐘相關(guān)基因直接受Nr1d1調控。此外,通過(guò)轉錄組分析表明Nr1d1還調控脅迫、代謝、信號傳導、翻譯后修飾等生理過(guò)程。
圖9 Nr1d1在生物鐘和細胞自噬過(guò)程中的作用模式圖
亮點(diǎn)
1.首次利用斑馬魚(yú)研究生物鐘和細胞自噬的關(guān)系;
2.發(fā)現Nr1d1在生物鐘調節和細胞自噬過(guò)程中的關(guān)鍵作用;
3.轉錄組研究進(jìn)一步證明Nr1d1的作用,并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.雖然轉錄組的內容在這篇文章中比重不大,但卻揭示了除了生物鐘調節和細胞自噬,Nr1d1基因還有很多其它的功能,顯著(zhù)提升了文章的水平,并為后續研究打好了基礎。