【項目文章】16s測序聯(lián)合轉錄組研究新思路

在瘤胃中的短鏈脂肪酸（SCFAs）對反芻動(dòng)物的生長(cháng)和健康起著(zhù)關(guān)鍵的作用，微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPR）和微生物脫乙?；福℉DAC）可能是這些影響的主要調節通路。該研究主要是選用不同比例非纖維碳水化合物攝入（15-30%）的山羊模型，通過(guò)轉錄組測序和16srRNA測序聯(lián)合研究瘤胃上皮細胞和瘤胃微生物協(xié)同的響應機制。通過(guò)研究發(fā)現，瘤胃中微生物來(lái)源的SCFAs對上皮細胞的生長(cháng)和代謝受到GPR和HDAC調節網(wǎng)絡(luò )的影響，通過(guò)對這些調控機制和飲食組成的相互關(guān)系的理解，可更深入的了解瘤胃的新陳代謝機制，更好的促進(jìn)牧業(yè)的發(fā)展。

樣品取材：共6只雄性山羊，隨機分為兩組，第一組飼養為65%的干草+35%的飼料（MC組），另一組為90%的干草+10%的飼料（LC組）；喂養28d后進(jìn)行取樣。

微生物多樣性樣品：飼養第28天，在清晨喂養0h、2h、5h以及8h進(jìn)行取樣，瘤胃內容物用4層紗布取樣 ，收集瘤胃液15ml，-20℃保存用于提取。

轉錄調控測序取樣：取10cm2瘤胃組織，用冷卻的PBS進(jìn)行清洗，去除肌肉層，取上皮組織切塊于TRIzol保存液保存。液氮速凍5min后，-80保存用于RNA提取。

短鏈脂肪酸（SCFAs）濃度測定：上述樣品加入5%HgCl2用于濃度測定。

測序分析：

瘤胃內容物微生物多樣性測序：細菌V3+V4區、Illumina Miseq 平臺測序

瘤胃上皮細胞轉錄組測序測序： PE125 測序、Illumina Hiseq2500 平臺測序

飼養不同處理組（MC和LC）、喂養取樣不同時(shí)間點(diǎn)間瘤胃內總短鏈脂肪酸（SCFA）、PH以及短鏈脂肪酸（SCFA）主要成分的變化情況進(jìn)行分析，如下圖。

?圖1.1?總SCFA變化情況

圖1.2?PH變化情況

圖1.3?SCFA主成分變化情況

2、瘤胃微生物多樣性分析：

2.1細菌群落結構分析

在細菌門(mén)水平，一共有14個(gè)原核的門(mén)被鑒定，主要是厚壁菌門(mén)（35.7-30.1%），擬桿菌門(mén)（26.6-43.6%）、互養菌門(mén)（11-7%），且通過(guò)門(mén)水平維恩圖分析發(fā)現，在兩組（MC和LC）間門(mén)水平組成相同，比較分析兩組間微生物變化情況發(fā)現（如圖：FIG2），MC組相比于LC組，互養菌門(mén)增長(cháng)了57%，無(wú)壁菌門(mén)增長(cháng)了330%。而黏膠球形菌門(mén)降低了63%，纖維桿菌門(mén)降低了65%；

圖2.1?兩組間門(mén)水平Venn圖分析

圖2.2 兩組間門(mén)水平OTU分析

在細菌屬水平。共鑒定出75個(gè)屬水平細菌，在兩組間共有70個(gè)屬，在MC組有三個(gè)特有的屬，在LC水平有2個(gè)特有的屬，普氏菌屬（10.4-17.9%）在兩組間都為主要屬水平的菌。

圖3.1 兩組間屬水平Venn圖分析

圖3.2?兩組間屬水平OTU分析

2.2 微生物群落的多樣性和豐富性

在門(mén)水平，MC組的擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)顯著(zhù)性高于Lc組（P＜0.05），互養菌門(mén)顯著(zhù)性低于Lc組（如下圖4），通過(guò)最大似然法（ML）計算27個(gè)豐度大于1% 的OTU進(jìn)行分析顯示，在MC組顯著(zhù)增加的OTU屬于子單胞菌科，疣微菌科、韋榮球菌科、疣微菌門(mén)，相反的，58%（7/12）顯著(zhù)降低的OTU屬于普雷沃氏菌科（如下圖5）；

?圖4

圖5

3.瘤胃表達譜分析：

3.1 瘤胃上皮細胞GPRs和HDACs的表達譜分析

RNA-Seq測序方法用于研究山羊瘤胃微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPRs）和微生物脫乙?；福℉DACs）表達情況以及調控網(wǎng)絡(luò )，過(guò)濾得到127M clean data，平均有83%數據比對到NCBI山羊參考基因組，得到73個(gè)GPR家族成員和11個(gè)HDAC家族成員比對到山羊基因組，轉錄組數據分析發(fā)現有20個(gè)GPR家族成員和7個(gè)HDAC家族成員在瘤胃上皮細胞中表達。通過(guò)比較LC組中基因的表達發(fā)現GPR1，87，89A，155顯著(zhù)上調（P＜0.05），在MC組中GPR107，游離脂肪酸受體4（FFAR4, also known as GPR120），羥基烴酸受體2（HCAR2, also known as GPR109A）顯著(zhù)上調（P＜0.05），通過(guò)組內基因表達分析，在兩組內都發(fā)現GPR家族中GPR87表達*高，HDAC家族中HDCA1的表達*高

3.2 GPRs和HDACs保守序列分析

為了研究GPR和HDAC在進(jìn)化過(guò)程中差異表達的保守序列，通過(guò)用所有基因進(jìn)行ML進(jìn)化樹(shù)分析，所有的 GPRS和HDACS在脊椎動(dòng)物門(mén)都是高度保守的。研究GPR家族內成員的保守序列發(fā)現，在GPR家族成員沒(méi)有超過(guò)30%的相似性，在HDAC家族成員之間也發(fā)現了同樣的結果。

圖6

3.3 差異表達的GPRS和HDACs基因相關(guān)KEGG通路分析

為了研究GPR和HDAC共表達網(wǎng)絡(luò )的生物學(xué)意義，改研究注釋了相關(guān)的信號通路和KEGG功能，發(fā)現顯著(zhù)差異的鄰近基因被分類(lèi)到瘤胃上皮細胞的生理調節過(guò)程，因此發(fā)現了兩類(lèi)和上皮細胞生長(cháng)調節有關(guān)系的功能網(wǎng)絡(luò )，其中一類(lèi)是上皮細胞生長(cháng)網(wǎng)絡(luò )（包括細胞凋亡，增殖和分化，見(jiàn)下圖7），另外一類(lèi)是上皮細胞的代謝網(wǎng)絡(luò )（包括輔酶因子和維生素代謝，能量代謝、氨基酸代謝等，見(jiàn)下圖8）；

圖7：上皮細胞生長(cháng)網(wǎng)絡(luò )圖

圖8：上皮細胞代謝網(wǎng)絡(luò )圖

在上皮細胞生長(cháng)網(wǎng)絡(luò )中，基因GPR1，89和155的表達上調導致LAMTOR3蛋白，蛋白激酶和ELK1表達上調，這三種蛋白都存在于MAPK信號通路上，和細胞的增殖分化有關(guān)。此外，GPR1的 表達增加和酸性酰胺酶（ASAH1）的下調相關(guān)，ASAH1存在于調節細胞凋亡、生存和增殖的信號通路上。對于HDACs家族基因HDAC4,5,6和10基因的上調和五個(gè)調節細胞凋亡，生存和增殖基因的下調有關(guān)。

在上皮細胞代謝網(wǎng)絡(luò )中，GPR1、87和89A基因的上調表達與輔酶2、4以及4L（ND2，4，4L），ATP5H，NDUFA4有關(guān)，HDAC1的下調表達ND6的上調表達有關(guān)。以上所有相關(guān)的酶都和能量代謝的氧化磷酸化有關(guān)。

4.轉錄調控和16s rRNA數據聯(lián)合分析?

GPR和HDAC的表達、SCFAS主成分濃度比例以及屬水平細菌相對豐度關(guān)系分析

通過(guò)CCA相關(guān)性分析發(fā)現，顯著(zhù)上調的GPRs和HDACs與8個(gè)顯著(zhù)增加的微生物屬（56個(gè) OTUS）是呈正相關(guān)，顯著(zhù)下調的GPRs和HDACs和9個(gè)顯著(zhù)減少的細菌屬呈正相關(guān)（63個(gè)OTU），然而HDAC1與丁酸鹽的比例呈負相關(guān)。

該研究得到的結果揭示，SCFA調節的GPR和HDAC共調控網(wǎng)絡(luò )存在于瘤胃的上皮細胞，該共調節網(wǎng)絡(luò )作用可作用于動(dòng)物敏感√確地接受微生物區的信號調節，這些調控網(wǎng)絡(luò )調節上皮細胞各種生理學(xué)過(guò)程，尤其是細胞的生長(cháng)和新陳代謝，在促進(jìn)動(dòng)物的生長(cháng)和維持上皮細胞的完整性起到關(guān)鍵的作用。此外，這些調控網(wǎng)絡(luò )重要的調控機制對于共生的細菌來(lái)說(shuō)，主要通過(guò)調節上皮細胞生理過(guò)程提高細菌在宿主中的共生條件。通過(guò)了解宿主動(dòng)物和微生物區之間互相的調節機制，加上相應飲食中的外界干預調節因素，可以可持續性的更好的提高動(dòng)物的健康和生長(cháng)。