單細胞測序樣品準備過(guò)程方案及制備方法流程

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客平臺單細胞產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。

1.2聲明

我國法定的傳染病分為三大類(lèi)：甲類(lèi)（一類(lèi)）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類(lèi)（二類(lèi)）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲(chóng)、瘧疾。丙類(lèi)（三類(lèi)）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規定，為嚴格遵守國家法律法規，本著(zhù)對社會(huì )及相關(guān)操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶(hù)方真實(shí)準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶(hù)方需要提供符合生物安全等級要求的實(shí)驗室以便開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗，實(shí)驗進(jìn)行時(shí)，客戶(hù)方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗員做好實(shí)驗安全防護?？蛻?hù)方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現樣品含有感染性病原體而客戶(hù)事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現我司將停止進(jìn)行相關(guān)項目，已產(chǎn)生的費用由客戶(hù)方承擔。如因客戶(hù)方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規定報告國家相關(guān)部門(mén)，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責任。

2.1送樣量要求

目前百邁客單細胞產(chǎn)品包含：?jiǎn)渭毎D錄組、單細胞核轉錄組、單細胞免疫組庫、單細胞ATAC，不同類(lèi)型單細胞產(chǎn)品具體送樣量要求如下表：

2.2樣本質(zhì)量要求

3.1動(dòng)物單細胞轉錄組/單細胞免疫組庫

3.1.1 新鮮動(dòng)物組織樣本

1）采集前準備：

實(shí)驗前分別提前24小時(shí)4℃預冷4個(gè)冰袋，-20℃預冷2個(gè)冰袋。

2）組織處理：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為200mg（黃豆粒大?。?；

B.去除周?chē)闹?、結締組織或者壞死組織，用預冷的無(wú)菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)；

C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過(guò)1cm，保證組織塊能夠充分接觸組織保存液，完全浸沒(méi)在組織保存液中，快速轉移到解離實(shí)驗室進(jìn)行單細胞懸液制備，或者寄送到百邁客實(shí)驗室進(jìn)行解離。

3）樣本寄送與運輸：

A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個(gè)樣品管上清晰、簡(jiǎn)明地標記樣品名稱(chēng)（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱(chēng)請避免出現漢字，采用字母和數字表示，長(cháng)度控制在8個(gè)字符以?xún)龋?/p>

B.樣本管用氣泡膜或紗布包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導致組織冰凍而壞死，請根據運輸時(shí)間確認冰袋的數量，確保樣本運輸到達目的地時(shí)，樣本溫度保持在2-8℃。

4）注意事項：

A.取樣時(shí)用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀進(jìn)行取樣，如必須用電刀取樣請避免電刀灼燒部位，取樣避免壞死部位，取樣不能有血凝塊；

B.公司承接樣本及樣本注意事項詳情請見(jiàn)”單細胞（核）物種組織白名單”。

C.采樣前可以提前聯(lián)系百邁客當地銷(xiāo)售經(jīng)理獲取組織保護液，由百邁客實(shí)驗室寄送分裝好的組織保存液（美天旎，貨號130-100-008），組織保護液在2-8℃保存，不建議過(guò)多囤放以防滋生細菌，使用前觀(guān)察試劑狀態(tài)是否為無(wú)色透明液體，無(wú)沉淀、無(wú)異樣；

D.組織在組織保護液中的最佳儲存時(shí)間為48h，可維持組織樣本的細胞活性及完整細胞表位，具體操作方法可參考《百邁客組織保存液寄樣指南》視頻，可以聯(lián)系百邁客當地銷(xiāo)售經(jīng)理獲取。

送樣不規范示例：

A.樣本沒(méi)有紗布包裹，與冰袋直接接觸，導致樣本結冰，解離活率不足；

B.組織太多，占滿(mǎn)整個(gè)管子，組織與保護液接觸面積很少，使保護液無(wú)法有效的保持組織活性；

C.樣本結冰，組織被完全凍住，解離活率很低；

D.未將管口包裹住，樣本運輸過(guò)程中管口打開(kāi)，保護液和部分組織灑落在管外。

3.1.2 血液樣本

1）樣本采集：

A.采集新鮮外周血至少3mL，迅速置于EDTA抗凝管（紫色）中保存，取樣完成后需要立即輕柔管上下顛倒采血管4-6次，保證EDTA抗凝效果；

B.4℃、24h內轉移到實(shí)驗室，分離PBMC后進(jìn)行后續實(shí)驗；

C.或者利用淋巴細胞分離液分選出外周血單核細胞PBMC（分選步驟可參考第3.2部分），加入細胞凍存液梯度凍存，具體操作見(jiàn)第3.1.3部分（推薦上門(mén)服務(wù)）；

2）樣本寄送與運輸：

A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個(gè)樣品管上清晰、簡(jiǎn)明地標記樣品名稱(chēng)（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱(chēng)請避免出現漢字，采用字母和數字表示，長(cháng)度控制在8個(gè)字符以?xún)龋?/p>

B.樣本管用氣泡膜包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導致組織冰凍而壞死，請根據運輸時(shí)間確認冰袋的數量，確保樣本運輸到達目的地時(shí)，樣本溫度保持在2-8℃。

3）注意事項：

A.取樣前需要確認EDTA抗凝管在保質(zhì)期范圍內，只能用EDTA紫色抗凝管；

B.百邁客可以提供PBMC分離服務(wù)；

C.血液離體時(shí)間不超過(guò)24h。

3.1.3 PBMC/細胞懸液樣本

PBMC樣本與細胞懸液樣本，如果沒(méi)有預約上門(mén)服務(wù)，需要按細胞梯度凍存的方式凍存起來(lái)，干冰寄送，細胞梯度凍存操作步驟如下：

A.凍存前準備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復至室溫備用；

B.準備好900μL血清+100μL DMSO的細胞凍存液；

C.收集PBMC或細胞，用預冷的無(wú)菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進(jìn)行細胞重懸；

D.將重懸好的細胞懸液分裝到細胞凍存管中，并在凍存管側壁做好標記；

E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進(jìn)行冷凍運輸，寄送到百邁客實(shí)驗室。

3.1.4 穿刺樣本

1）樣本采集：對于穿刺樣本，在采集樣本過(guò)程中，使用粗針(穿刺針管外徑≥1.2mm)穿刺采集3條樣本。

2）注意事項：

A.組織處理、樣本寄送與運輸參考第1.1部分；

B.采集時(shí)需注意的是不能用真空針采樣；

C.穿刺樣品量較少，建議送樣量≥3條，通過(guò)增加穿刺樣本數可以提高成功率。

3.2 動(dòng)物單細胞核轉錄組/單細胞ATAC

3.2.1 冷凍組織樣品

1）樣本采集與寄送：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為250mg；

B.去除周?chē)闹?、結締組織或者壞死組織，用預冷的無(wú)菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)，并用紗布或無(wú)塵紙擦干組織表面水分；

C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過(guò)1cm，組織分成兩份，一份150mg，一份100mg并做區分標記，分別轉入兩個(gè)凍存管中，150mg提取細胞核，100mg提取質(zhì)檢RNA（要求 RIN≥6.0）；

D.立即液氮速凍30min以上，再轉移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實(shí)驗室后為冷凍狀態(tài)。

2）注意事項：

心臟、肌肉、皮膚、肺癌、子宮、病變纖維化和器官硬化類(lèi)組織，提核后會(huì )產(chǎn)生較多的碎片，需要進(jìn)行流式分選去碎片；如果涉及到以上樣本，請送樣前提前告知，以便開(kāi)始提核實(shí)驗前預約好流式細胞儀，以免耽誤實(shí)驗進(jìn)度。

3.2.2 凍存細胞樣本

1）凍存前細胞質(zhì)檢：凍存前對細胞質(zhì)量進(jìn)行檢測，要求細胞活性大于90%、細胞結團率小于 10%，樣品無(wú)細胞碎片等雜質(zhì)；原代細胞或培養細胞總數大于1×10⁶個(gè)，流式分選細胞大于5×10⁵個(gè)，并提供質(zhì)檢結果。

2）細胞梯度凍存：

A.凍存前準備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復至室溫備用；

B.準備好900μL血清+100μL DMSO的細胞凍存液；

C.收集PBMC或細胞，用預冷的無(wú)菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進(jìn)行細胞重懸；

D.將重懸好的細胞懸液分裝到細胞凍存管中，并在凍存管側壁做好標記；

E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進(jìn)行冷凍運輸，寄送到百邁客實(shí)驗室。

3.2.3 其他類(lèi)

血液樣本參考第3.1.2部分，PBMC/細胞懸液樣本參考第3.1.3部分，推薦直接上門(mén)服務(wù)。

3.3?植物單細胞核轉錄組

3.3.1?新鮮植物組織樣品

1）活體植株（優(yōu)先推薦）

A.幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗（7-14 天）、組培苗——葉片、幼嫩莖、莖尖、根尖；

B.成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2片幼嫩葉片、發(fā)育中的花或者花序；

C.取樣量：保證每一個(gè)單細胞核轉錄組文庫的理論用量 0.5-2g；

D.其它：特殊貴重活體樣品需要客戶(hù)提供樣品的種植、保存條件（溫度、光照、營(yíng)養液、澆水條件、PH 等等），以保證樣品的正常生長(cháng)；

E.每一個(gè)根部保留少量土壤，利用錫箔紙或者塑料薄膜將植株根部包裹起來(lái)， 植株部分需要利用小鐵環(huán)或者絲帶纏繞，保證枝條莖葉不分散，但不需要捆綁非常緊實(shí)，防止機械對莖枝葉的損傷。

F.外面用紙箱或者泡沫包裹，防止植株碰撞，并用塑料薄膜纏繞固定。

G.一般活體植株常溫運輸培養，如果有特殊培養條件（需要做相應的處理，例如，低溫用冰袋運輸，冰袋與密封袋之間放置泡沫板）。

2）離體枝條

A.枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉；枝條中下端保留部分成熟葉片；

B.枝條預處理：剪斷枝條，自底端往上約5cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋，袋中噴水，填充部分空氣，密封袋口；

C.枝條運輸：自封袋放入泡沫箱，箱體內側壁放部分冰袋（保證低溫運輸），冰袋與自封袋間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導致樣品被凍傷；

D.運輸時(shí)間：保證24 h內到樣，最多不得超過(guò)48 h；

E.取樣量：保證每一個(gè)單細胞核轉錄組文庫的理論用量 0.5-2g；

F.其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過(guò)大等導致的取樣或運輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實(shí)驗；離體枝條如果保存、運輸不善會(huì )存在部分潛在風(fēng)險：即得到的實(shí)驗效果可能會(huì )比活體植株檢測結果稍差（理論上的潛在風(fēng)險）。

3）注意事項

A.建議一次送樣量≥2g；

B.所有待取的幼嫩組織長(cháng)勢必須正常（無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)營(yíng)養缺失）；

C.對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時(shí)不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第 1-2 片嫩葉；

D.部分植物單細胞核項目（物種及組織類(lèi)型在我司白名單之外）在正式啟動(dòng)前會(huì )進(jìn)行預實(shí)驗以判斷能否順利開(kāi)展正式實(shí)驗，故活體樣本送樣時(shí)應保證至少3天的啟動(dòng)延時(shí)（即活體樣本到樣后需等待3天至預實(shí)驗合格后方能正式啟動(dòng)樣本，如對時(shí)期要求嚴格的樣本需格外注意），送樣前可與我司溝通確認具體情況。

3.3.2?冷凍組織樣品

1）樣本采集與寄送：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為700 mg；

B.去除周?chē)姆悄繕私M織，用預冷的無(wú)菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉雜質(zhì)；

C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成0.5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過(guò)1cm，剪切成約0.5 cm,不足0.5 cm的從中間切開(kāi)即可；

D.將組織分成兩份，一份600mg，一份100mg并做區分標記，其中600 mg用來(lái)提取細胞核，100 mg用來(lái)提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；

E.立即液氮速凍30min以上，再轉移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實(shí)驗室后為冷凍狀態(tài)。

4.1 懸液制備方案評估

由于不同物種和組織類(lèi)型的解離條件差異較大，百邁客提供單細胞懸液制備預實(shí)驗服務(wù)，會(huì )對目標組織類(lèi)型的單細胞懸液制備方案進(jìn)行評估。提前預約好樣本寄送時(shí)間，保證到樣后盡快開(kāi)展單細胞懸液制備實(shí)驗，組織凍存液寄送樣本最好在48h內完成解離；確定好細胞懸液制備方案后，即可正式開(kāi)展項目。

4.2 正式實(shí)驗

目前百邁客提供兩種類(lèi)型的正式實(shí)驗服務(wù)模式：

4.2.1 上門(mén)服務(wù)

老師只需提供組織樣本，預約上門(mén)后實(shí)驗工程師上門(mén)，按照預實(shí)驗評估的解離方案進(jìn)行解離、單細胞分選上機、反轉錄成cDNA后低溫暫存，后續在百邁客實(shí)驗室完成建庫測序。

或者老師完成單細胞懸液制備實(shí)驗，實(shí)驗工程師進(jìn)行單細胞懸液質(zhì)量評估，評估合格后進(jìn)行后續實(shí)驗操作，單細胞質(zhì)量要求見(jiàn)第2.2部分。

備注：單細胞懸液制備好后，建議在30分鐘內質(zhì)檢上機，建議老師提前安排好時(shí)間；儀器設備要求詳情見(jiàn)第4.3.3部分。

4.2.2 組織寄送

百邁客單細胞組織保存液寄送方式（推薦），采用組織保存液儲存組織樣本，既可以保持樣本最原始組織活性狀態(tài)，又可以解決樣本難以獲取以及批次性效應等問(wèn)題，老師寄送組織到百邁客實(shí)驗室，實(shí)驗工程師進(jìn)行解離、單細胞分選上機、反轉錄、建庫、測序。

注意事項

• 根據組織類(lèi)型選擇服務(wù)模式：適用于組織保存液寄送的組織推薦組織，寄送，其他不適用寄送的組織類(lèi)型、細胞、血液樣本推薦上門(mén)服務(wù)；
• 一些特殊樣本由于組織結構、細胞大小等限制，在不適用單細胞轉錄組測序的情況下，可以進(jìn)行單細胞核轉錄組測序。

4.2.3 儀器耗材清單

注意事項：

1）標記*的設備需放置在同一房間；

2）實(shí)驗臺大小要求能滿(mǎn)足兩名實(shí)驗員操作；

3）三孔儀器電源插座大于3 個(gè)；

4）生物安全柜可用常規實(shí)驗臺代替。

4.3 風(fēng)險提示與評估

1）組織保存液寄送樣本盡量保證48h內寄送到實(shí)驗室開(kāi)展實(shí)驗，時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )影響細胞活率及細胞表達狀態(tài)；

2）單細胞核轉錄組組織樣本一定要備份進(jìn)行質(zhì)檢（RIN值≥6.0），RNA完整性會(huì )影響數據結果；

3）細胞活率低于85%，可能引起mRNA部分降解導致基因檢出減少，細胞內線(xiàn)粒體基因比例偏高，占用有效數據量；

4）細胞直徑<40 μm（10x）或<60 μm（DG）細胞過(guò)大容易堵塞芯片，無(wú)法形成油包水，過(guò)大的細胞利用細胞篩過(guò)濾；

5）細胞結團<15%，組織解離不充分，會(huì )看到細胞懸液中2個(gè)或多個(gè)細胞粘連在一起的情況，可能會(huì )導致最終數據中雙細胞占比偏多，占用有效數據量，結團過(guò)高還可能會(huì )堵塞芯片，無(wú)法形成油包水；

6）解離過(guò)程中可能由于解離條件過(guò)于劇烈而產(chǎn)生大量碎片，可能會(huì )導致背景噪音高，占用有效數據量，也會(huì )引起有效細胞數偏離預期。