闡明種子傳播的E.gansuensis內生真菌增加醉馬草對NaCl脅迫的耐受性分子機制

中文名:闡明種子傳播的E.gansuensis內生真菌增加醉馬草對NaCl脅迫的耐受性分子機制

英文名:Elucidating the Molecular Mechanisms by which Seed-Borne Endophytic Fungi, Epichlo? gansuensis, Increases the Tolerance of Achnatherum inebrians to NaCl Stress

雜志：IntJMolSci

影響因子：4.556

研究背景

A.inebrians與種子傳播的內生真菌Epichlo?gansuensis形成共生關(guān)系，這是其對生物和非生物脅迫的適應性和生產(chǎn)力的重要因素。這種共生為A.inebrians提供了幾個(gè)優(yōu)勢，包括抗鹽和抗旱性，提高水和氮的利用效率并增加生物量。此外，它還提高了氮代謝的酶活性，耐鎘，清除活性氧和抗病蟲(chóng)害的能力。植物與Epichlo?內生菌的共生可能調節生長(cháng)之間的權衡和寄主草對非生物脅迫的抗性。這可能是兩者相互作用的結果，Epichlo?增強寄主草對非生物脅迫的耐受性并促進(jìn)植物生長(cháng)。與非共生植物相比，共生植物通常表現出更多的分蘗和生物量。Epichlo?gansuensis與Achnatheruminebrians形成穩定的關(guān)聯(lián)，是研究本地草和真菌內生菌相互作用的理想宿主。

研究目的

高通量測序是一種有效的方法用轉錄本來(lái)探索原生草對非生物脅迫的反應，即使沒(méi)有參考基因組序列。以前的研究表明，許多差異表達寄主草的基因受Epichlo?內生菌的影響。在目前的研究中，我們探索了A.inebrians的全長(cháng)轉錄本信息，評估了其作用在200mMNaCl脅迫下E.gansuensis感染對A.inebrians生長(cháng)的影響并通過(guò)Illumina測序在A(yíng).inebrians的葉子中確定參與轉錄本對醉馬草產(chǎn)生反應的基因。研究旨在探索內生真菌E.gansuensis感染后NaCl脅迫下宿主草的轉錄組，并提供E.gansuensis增加NaCl的寄主草耐受性的分子機制見(jiàn)解。

材料方法

12Epichlo?gansuensi感染（E+植物）和未感染的種子（E-植物）A.inebrians播種在16個(gè)盆中，種子發(fā)芽一周后，每個(gè)花盆每周澆150mL1/2Hoagland，同時(shí)每個(gè)花盆每周澆200毫升蒸餾水。6周后，4個(gè)E+苗盆和4個(gè)E-苗盆用150mL的1/2Hoagland和0mMNaCl澆灌，4個(gè)E+幼苗花盆和4個(gè)E-苗盆用150mL的1/2Hoagland與200毫升氯化鈉處理4周；同時(shí)對4個(gè)E+苗盆和4個(gè)E-苗盆每周200mL蒸餾水處理，4個(gè)E+苗盆和4個(gè)E-苗盆每周用200mL蒸餾水和200mMNaCl。4周后取0mM和200mMNaCl濃度下的E-植物（葉和根混合）的總RNA根據制造商的方案，通過(guò)植物RNA提取試劑盒并用DNaseI消化以去除基因組DNA，用PacBio測序全長(cháng)轉錄組。此外，共有12個(gè)RNA樣本來(lái)自在0mMNaCl和提取200mMNaCl以通過(guò)Illumina測序。提取的RNA檢測和定量使用安捷倫生物分析儀2100和Nanodrop2000。

研究結果

1、基于SMRT的RNA測序

采用PacBio測序平臺進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測序，獲得芨芨草全長(cháng)轉錄組信息。從單個(gè)E-植物中收集葉子和根，徹底混合并用于mRNA提取。構建了全長(cháng)cDNA文庫，隨后用SMRT測序（補充圖S1A）。我們獲得了940,319個(gè)ROI（總堿基：1,789,709,871），其中包括6.41%的全長(cháng)嵌合序列和78.55%全長(cháng)非嵌合序列（補充圖S1B和表S1）。此外，738,588個(gè)全長(cháng)非嵌合序列、60,317個(gè)全長(cháng)嵌合序列和68,878個(gè)轉錄本，轉錄本的平均讀取長(cháng)度為1832bp。

2、ORF和SSR的預測

E?A.inebrians總共預測了34,764個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)和27,202個(gè)完整的ORF。長(cháng)度分布表明長(cháng)度為800~1200的ORF為5,926個(gè)（補充圖S2）。在大多數生物體中，簡(jiǎn)單序列重復（SSR）是一個(gè)重要的分子標記，我們的結果表明E?A.inebrians檢測到15,945個(gè)的SSR，其中大多數具有單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復和四核苷酸重復（補充表S2）。由于SMRT測序序列的高組裝質(zhì)量，SSR的信息可用于E?A.inebrians未來(lái)的遺傳分析和標記輔助育種。

3、轉錄本的功能注釋和轉錄因子的分類(lèi)

總體而言，94.16%的A.inebrians轉錄本在選定的數據庫中進(jìn)行了注釋?zhuān)⑶覇蝹€(gè)數據庫的成功率在41.54%到93.83%之間。GO，KEGG，COG，KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和NR注釋率分別為82.05%、41.54%、42.07%、57.65%、79.78%、68.45%、92.44%和93.83%（補充表S3）。這些結果表明，大多數基因是真正轉錄的序列，而且很可能A.inebrians中的功能基因。此外，我們獲得了63個(gè)轉錄基因家族因子（TF）并確定了1536個(gè)A.inebrians的推定TF成員（補充表S4)。此外，MYB相關(guān)TF、bHLHTF、NACTF和bZIPTF占大比例（補充圖S3）。

4、E.Gansuensis在各種NaCl濃度下改變了A.Inebrians的轉錄本

進(jìn)一步闡明E.gansuensis在NaCl脅迫下對寄主植物生長(cháng)的分子機制，E+和E-A.inebrians葉片（28天齡）的轉錄組通過(guò)Illumina測序進(jìn)行分析。E+A.inebrians和E-A.inebrians用含0mMNaCl和200mMNaCl濃度處理。閾值FDR≤0.01和FC≥2用于確定DEG（差異表達基因）。結果顯示響應E.gansuensis的轉錄本發(fā)生顯著(zhù)變化，在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下的分別發(fā)生2464和1817DEGs（圖1）。此外，在NaCl脅迫下，轉錄本發(fā)生了顯著(zhù)變化，E+葉子的4919個(gè)DEG。然而，一個(gè)小的轉錄組變化發(fā)生在對NaCl脅迫的響應，E-葉為502DEG（圖1）。

5、E.Gansuensis調節A.Inebrians的不同生物過(guò)程以維持生長(cháng)與抗NaCl脅迫之間的平衡

E.gansuensis上調1269個(gè)基因，下調1195個(gè)0LE+基因（葉E+植物在0mMNaCl下）與0LE-（E-植物在0mMNaCl下的葉子）相比。類(lèi)似地，E.gansuensis誘導844個(gè)基因并抑制200LE+（E+植物的葉子）的973個(gè)基因在200mMNaCl下）與200LE-（E-植物的葉子在200mMNaCl下）相比（圖1）。目前的結果表明在NaCl脅迫下E.gansuensis對基因的調控有巨大的影響與200mMNaCl相比。對0LE+和0LE-之間的DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現，E.gansuensis主要誘導“鈉離子跨膜轉運”、“胚胎后發(fā)育的正調控”、“蛋白質(zhì)磷酸化”、“光系統化學(xué)計量調整”和“谷氨酸代謝過(guò)程”（圖2A）。此外，GO富集分析表明，類(lèi)別“類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”、“氧化-還原”過(guò)程”和“陰離子跨膜轉運”在下調中富集E.gansuensis在0mMNaCl濃度下的DEGs（圖2B）。這些結果暗示E.gansuensis重新編排了植物生理學(xué)和重要生物學(xué)的許多方面提高寄主植物的競爭力。GO富集分析在200LE+和200LE?之間的DEGs表明，E.gansuensis主要誘導“蛋白質(zhì)磷酸化”、“氧化還原過(guò)程”、“油菜素類(lèi)固醇生物合成過(guò)程”、“細胞鈣離子穩態(tài)”和“L-谷氨酸轉運”（圖2C）；此外，GO富集分析發(fā)現“蛋白質(zhì)磷酸化”的類(lèi)別，“果糖6-磷酸代謝過(guò)程”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”和“MAPK”在200mMNaCl濃度下，E.gansuensis在下調的DEG中富集級聯(lián)”（圖2D）。我們的研究結果表明，E.gansuensis通過(guò)激活細胞信號轉導促進(jìn)宿主在脅迫環(huán)境下的生長(cháng)，維持平衡。促進(jìn)ROS、Ca2+信號和油菜素類(lèi)固醇(BR)的生物合成，它們在抗壓過(guò)程中起作用。

6、E.Gansuensis在A(yíng).Inebrians兩種氯化鈉濃度中轉錄本重排中起的獨特作用

Venn結果顯示E.gansuensis僅上調1135DEG在0mMNaCl濃度下的LE+和LE-之間，E.gansuensis在200mMNaCl脅迫下僅上調LE+和LE-之間的710DEG；此外，134DEG的LE+與LE-在E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl（補充圖S4A）。同樣，E.gansuensis在0mMNaCl和E.gansuensis僅下調LE+和LE-之間的928DEG僅在A(yíng).inebrians中下調LE+和LE-之間的706DEG作為響應至200mMNaCl（補充圖S4B）。分析結果表明這些特殊的上調或下調的LE+與LE-的DEG的GO富集0mMNaCl和200mMNaCl分別顯示磷酸化信號，次生代謝物的合成和轉運，以及離子跨膜轉運A.inebrians主要富集于E.gansuensis獨特的上調DEGs在0mMNaCl濃度下（圖4A）。GO富集分析結果表明A.inebrians的“蛋白質(zhì)磷酸化”、“類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉運”、“果糖6-磷酸代謝過(guò)程”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”和“磷酸化信號轉導”主要在200mM甘肅E.gansuensis獨特的上調DEG中富集NaCl濃度(圖4C)。細胞信號轉導通路（“蛋白磷酸化”和“細胞表面受體信號通路”）、“類(lèi)黃酮生物合成A.inebrians的“過(guò)程”、“細胞表面受體信號通路”、“葡萄糖輸入”、“陰離子跨膜轉運”和“細胞分裂”主要富集于E.gansuensis在0mMNaCl和200mMNaCl濃度下共享上調的DEG（圖4B）。E.gansuensis主要僅抑制“黃酮類(lèi)葡萄糖醛酸化”、“葡萄糖輸入”、“長(cháng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程”、“黃酮類(lèi)生物合成過(guò)程”、“陰離子跨膜轉運”和“氧化還原過(guò)程”的A.inebrians，主要在獨特的下調DEG中富集由E.gansuensis在0mMNaCl濃度下（圖4D）?！暗鞍踪|(zhì)磷酸化”、“果糖6-磷酸代謝過(guò)程”、“黃酮類(lèi)葡萄糖醛酸化”、“通過(guò)果糖-6-磷酸進(jìn)行糖酵解過(guò)程”，“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”，“調節蛋白磷酸酶2A型活性”，“鉀離子跨膜”A.inebrians的運輸”和“MAPK級聯(lián)”主要富集于獨特的甘肅大腸桿菌在200mMNaCl濃度下下調DEG（圖4F）。細胞信號轉導（“蛋白質(zhì)磷酸化”和“細胞表面受體信號通路”）、次生代謝產(chǎn)物（“類(lèi)黃酮”生物合成過(guò)程”、“絲氨酸家族氨基酸生物合成過(guò)程”和“細胞氨基酸代謝過(guò)程”）和“過(guò)氧化氫分解代謝過(guò)程”A.inebrians主要在0mMNaCl和200mMNaCl的E.gansuensis共享的下調DEG中富集（圖4E）。

7、NaCl脅迫對A.InebriansE+和E—植物中轉錄本重排的獨特影響

NaCl脅迫僅上調LE+和LE+之間的2015DEG，且僅NaCl脅迫在LE-和LE-之間上調139DEG（補充圖S4C）。氯化鈉脅迫僅在LE+和LE+之間下調4707DEG，NaCl脅迫僅下調LE-和LE-之間的290DEG（補充圖S4D）。分析結果這些特殊上調的DEG在0mMNaCl與200mMNaCl下的GO富集度LE+和LE-分別表明NaCl脅迫主要調節氧化還原過(guò)程、次生代謝物的生物合成、小分子轉運和細胞信號轉導，主要富集在LE+和LE-中獨特的上調DEGs（圖5A，C）。例如“氨基酸跨膜轉運”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”、“鉀離子跨膜轉運”、“葡萄糖輸入”、“L-α-氨基酸跨膜轉運”、“陰離子跨膜轉運”、“信號轉導”A.inebrians的磷酸化”、“MAPK級聯(lián)”、“氧化還原過(guò)程”和“過(guò)氧化氫分解代謝過(guò)程”主要富集于獨特的上調氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5C）。次生物質(zhì)的代謝和運輸代謝物（“一元10羧酸代謝過(guò)程”、“蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程”和“脂質(zhì)代謝過(guò)程”），ROS信號（“過(guò)氧化氫分解代謝過(guò)程”和“細胞對過(guò)氧化氫的反應”）和A.inbrians的“蛋白質(zhì)磷酸化”主要富集分別在LE+和LE-之間的NaCl脅迫下共享上調的DEG（圖5B）。類(lèi)似地，“蛋白質(zhì)磷酸化”、“類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”、“氨基酸跨膜轉運”、“鉀離子跨膜”轉運”、“鈣離子跨膜轉運”和“谷氨酸代謝過(guò)程”A.inebrians主要富集在NaCl下LE+中獨特的下調DEGs壓力（圖5D）。次生代謝物的合成和轉運（“黃酮類(lèi)葡萄糖醛酸化”、“氨基酸跨膜轉運”、“類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程”和“長(cháng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程”）、“鉀離子跨膜轉運”、“氧化-還原過(guò)程”和信號轉導途徑（“磷酸化信號轉導”A.inebrians的“MAPKcascade”）主要富集于獨特的下調氯化鈉脅迫下LE-中的DEGs（圖5F）。次生物質(zhì)的代謝和運輸代謝物（“氨基酸跨膜轉運”、“脂質(zhì)代謝過(guò)程”、“氨基酸進(jìn)口”、“糖酵解過(guò)程”和“一元羧酸代謝過(guò)程”）、“陰離子跨膜轉運”、“氧化還原過(guò)程”和“陰離子穩態(tài)”。主要富集于LE+和NaCl脅迫下共享的下調DEGsLE-(圖5E)

8、E.gansuensis在NaCl脅迫下對A.Inebrians轉錄因子表達模式的影響

E.gansuensis在0mMNaCl下調節A.inebrians的16個(gè)轉錄因子(TFs)濃度，有10個(gè)上調的TF和10個(gè)下調的TF；上調的TF包括MYB相關(guān)、bHLH、CAMTA、B3-ARF、C2H2、GARP-G2樣、MADS-M型和1個(gè)TrihelixTF（補充圖S5A），其中MYB相關(guān)的TF最多與0mMNaCl的其他TF相比，對內生真菌敏感。下調的TF包括GRAS、CPP、HSF、AP2/ERF-ERF、C2C2-LSD、NAC、C3H、bHLH、bZIP和MYB相關(guān)的TF（補充圖S5A）。E.gansuensis影響了A.inebrians的14個(gè)TFs200mMNaCl濃度，有5個(gè)1112上調的TF和12個(gè)下調的TF；這上調的TF，包括HB-HD-ZIP、MYB、NAC、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2H2、C3H、GARP-G2-like、GRAS、HSF、WRKYTFs和NACTFs受到顯著(zhù)影響通過(guò)200mMNaCl脅迫下的內生菌（補充圖S5B）；下調TF包括3個(gè)B3-ARF、1個(gè)HB-BELL、1個(gè)HB-HD-ZIP、2個(gè)MYB和1個(gè)NACTF（補充圖S5B）。此外，NaCl脅迫調節了LE+中A.inebrians的30個(gè)TF，具有23個(gè)上調的TF和17個(gè)下調的TF；上調的TF包括AP2/ERFAP2、C2C2-CO-like、C2C2-Dof、C2C2-LSD、CPP、FAR1、GARP-G2-like、GRAS、HB-BELL、NF-YC、RWP-RK、WRKY、zf-HD、AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、HSF、LOB、MYB相關(guān)和NACTF（補充圖S5C）。下調的TF包括AP2/ERF-ERF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、C2H2、C3H、2HSF、LOB、MYB相關(guān)，NAC、B3、B3-ARF、BES1、HB-HD-ZIP、MYB、Tify和Trihelix，與MYB相關(guān)，NAC和WRYKTFs在LE+中受到NaCl脅迫的顯著(zhù)影響（補充圖S5C)。NaCl脅迫調節LE+中A.inebrians的7個(gè)TF，其中2個(gè)上調TFs和5個(gè)下調的TFs；上調的TF包括兩個(gè)WRKY和一個(gè)NF-YCTFs，而下調的TFs包括bZIP、GARP-G2-like、HSF、三種MYB相關(guān)和一個(gè)NF-YATF（補充圖S5D）。

9、E.Gansuensis改變與類(lèi)黃酮生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達、光合作用、植物激素信號轉導和氨基酸代謝在氯化鈉壓力下

E.gansuensis顯著(zhù)激活10個(gè)基因和5個(gè)光合作用基因分別為0mM和200mMNaCl濃度下。E.gansuensis的作用寄主植物的光合作用基因更明顯在0mMNaCl下比200mM氯化鈉（圖6A）。此外，E.gansuensis顯著(zhù)激活植物的五個(gè)信號傳導基因在0mMNaCl濃度下；這些基因包括乙烯信號通路的兩個(gè)基因、生長(cháng)素信號通路的兩個(gè)基因和脫落酸信號通路的一種基因。然而，E.gansuensis沒(méi)有顯著(zhù)激活植物激素信號轉導基因在200mMNaCl濃度13下(圖6B),這意味著(zhù)NaCl的影響大于E.gansuensis在植物激素基因表達方面的研究。E.gansuensis顯著(zhù)下激活植物激素信號轉導基因在0mMNaCl濃度下，但E.gansuensis在200mMNaCl濃度下顯著(zhù)調控兩個(gè)類(lèi)黃酮生物合成基因(圖6C)。E.gansuensis顯著(zhù)抑制氨基的八個(gè)基因在0mMNaCl濃度和E.gansuensis的酸代謝顯著(zhù)激活下激活植物激素信號轉導基因在200mMNaCl濃度下的（圖6D）。更遠，E.gansuensis顯著(zhù)下調甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，以及作為色氨酸代謝在0mMNaCl濃度下。E.gansuensis顯著(zhù)下調賴(lài)氨酸降解，上調精氨酸和脯氨酸代謝在200mMNaCl下。因此，很可能，E.gansuensis通過(guò)調節宿主氨基酸代謝來(lái)提高A.inebrians的耐鹽性。

文章亮點(diǎn)

本文通過(guò)全長(cháng)轉錄組結合二代轉錄組分析，研究了在NaCl脅迫下，E.gansuensis對宿主A.inebrians的重排生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生重大影響以適應各種NaCl濃度。結果表明內生真菌重塑宿主的基因表達以適應高鹽環(huán)境，探索了E.gansuensis提高寄主草對NaCl脅迫的耐受性的分子機制，PacBio測序獲得的轉錄本數據主要促進(jìn)了A.inebrians基因注釋?zhuān)M(jìn)一步推動(dòng)了基因研究功能。研究證明了內生真菌增加宿主對鹽脅迫的耐受性分子機制，為內生菌制造耐鹽草料分子育種提供理論依據。14