Nat Genet項目文章｜高質(zhì)量玉米抗旱種質(zhì)基因組組裝及遺傳解析

CIMBL55基因組的組裝與注釋

CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線(xiàn)分析

玉米基因組間遺傳變異對抗旱性的影響

表觀(guān)遺傳變異對玉米抗旱性的影響

ZmRtn16基因對玉米抗旱性的影響

主要研究結果

1.CIMBL55基因組的組裝與注釋

熱帶/亞熱帶（TST）玉米種質(zhì)CIMBL55具有顯著(zhù)的抗旱性，在干旱脅迫條件下，與B73和Mo17相比，CIMBL55的苗期存活率高，產(chǎn)量損失?。▓D1a-d）。本研究結合PacBio、Illumina、Hi-C和BioNano光學(xué)圖譜等技術(shù)對其進(jìn)行基因組組裝，最終組裝基因組大小為2,159.5Mb，contig?N50為14.3Mb，scaffold?N50為223.6Mb，隨后，通過(guò)Hi-C技術(shù)將scaffold掛載至10條染色體上（圖1e）。BUSCO分析表明，~98%的基因是完整存在的。隨機挑選9個(gè)BAC序列與基因組組裝比對表明，兩者具有很好的序列同源性。這些結果表明CIMBL55基因組具有高度完整性和準確性。CIMBL55、B73、Mo17和SK（另一種TST種質(zhì)）基因組共線(xiàn)性分析發(fā)現，在B73和CIMBL55間存在大的易位、重復和倒位事件；與B73和Mo17相比，CIMBL55和SK在Chr7上有~440 kb的缺失，在Chr8上有~560 kb的插入，表明這些差異可能在TST種質(zhì)中普遍存在。

基于從頭預測和同源比對預測對CIMBL55基因組的重復區域進(jìn)行注釋?zhuān)l(fā)現83.95%的基因組序列為轉座子元件?；趶念^預測、同源比對預測和轉錄組輔助預測在CIMBL55中共注釋了38,439個(gè)基因，平均基因長(cháng)度為4,289 bp。Circos圖顯示跨越染色體臂的DNA-TEs和蛋白編碼基因的分布模式相似，RNA-TEs的分布與著(zhù)絲粒較高的CG和CHG甲基化有關(guān)。

圖1?CIMBL55抗旱表型及基因組組裝

2. CIMBL55與B73玉米基因組的基因共線(xiàn)分析

基因共線(xiàn)性反映了不同基因組間的基因含量及其在染色體上的排列。CIMBL55與B73基因組之間的共線(xiàn)基因分析表明，73%的CIMBL55基因位于共線(xiàn)基因塊，27%的基因是非共線(xiàn)基因。共線(xiàn)基因進(jìn)一步可以分為三類(lèi)。1類(lèi)基因(42%)位于B73和CIMBL55的同源染色體上，多數為單拷貝基因(one-one syntenic)。2類(lèi)基因(29%)是位于各自基因組中兩條不同同源染色體上的重復基因(multi–multi synteny)（圖2b）。3類(lèi)基因(2%)位于CIMBL55當前組裝中未定位到染色體上的contigs中，但與B73中的相應基因處于共線(xiàn)性塊中。非共線(xiàn)基因包括class 4(16%)和class 5(11%)2類(lèi)基因。

RNA-seq分析發(fā)現，共線(xiàn)基因比非共線(xiàn)基因具有更高的轉錄豐度，表明基因組重排可能影響了基因的表達（圖2d）。玉米祖先經(jīng)歷了全基因組復制事件，然后是偏分鎦和二倍化。參考高粱基因組，構建了CIMBL55的亞基因組，發(fā)現其偏分鎦與B73一致，支持了玉米進(jìn)化過(guò)程的保守性。在CIMBL55的兩個(gè)亞基因組中，有61.5%的2類(lèi)基因為成對保留的，表明2類(lèi)基因在玉米進(jìn)化過(guò)程中保持相對保守。GO分析發(fā)現，這些基因在多種脅迫的應激反應中顯著(zhù)富集。進(jìn)一步對與ABA信號和干旱響應相關(guān)基因家族分析發(fā)現，72%的基因屬于2類(lèi)基因，顯著(zhù)高于全基因組水平上的2類(lèi)基因（29%）。這些結果表明，在玉米進(jìn)化過(guò)程中，參與環(huán)境響應和適應的基因傾向于成對保留。

圖2?CIMBL55和B73基因組的基因共線(xiàn)分析

3.遺傳變異對抗旱性的影響

為了確定CIMBL55抗旱性的遺傳機理，本研究在泛基因組水平上研究了25個(gè)NAM建立系和另外4個(gè)玉米品系SK、Mo17、K0326、A188的遺傳變異。共得到17,581,014個(gè)結構變異(SVs)（圖3a）。為了更深入地了解CIMBL55的基因組變異，以CIMBL55為參考，在B73和Mo17中鑒定到841,911個(gè)DNA變異(>20 bp)。隨后，在368份玉米自然群體中，成功對544,853個(gè)SVs進(jìn)行了基因型鑒定，并基于干旱后的幼苗存活率對其耐旱性進(jìn)行了分析。

此前研究中，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)和孟德?tīng)栯S機化分析分別鑒定了42個(gè)和97個(gè)抗旱性候選基因。作者在CIMBL55基因組中對這些位點(diǎn)的基因型進(jìn)行研究，鑒定得到108個(gè)抗旱基因。值得注意的是，在CIMBL55中發(fā)現了65個(gè)基因的優(yōu)異單倍型，解釋了CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎。此外，在108個(gè)基因中，有11個(gè)候選基因在非CIMBL55等位基因中被鑒定為優(yōu)勢單倍型，這表明其他種質(zhì)可能含有與CIMBL55互補的玉米抗旱性遺傳資源（圖3b）。

研究發(fā)現，位于ZmABF4基因第二內含子的SNP (S1474)和SV (S3205, 42 bp)與該基因的表達和苗期抗旱性密切相關(guān)。ZmABF4編碼bZIP轉錄因子，為ABA和干旱誘導表達的主要調節因子。攜帶ZmABF4^CIMBL55等位基因的種質(zhì)在基因表達和抗旱性方面明顯高于攜帶ZmABF4^B73等位基因的種質(zhì)（圖3d, e）。轉基因過(guò)表達分析發(fā)現，與野生型(WT)相比，ZmABF4轉基因株系在干旱脅迫下存活率顯著(zhù)提高，葉片失水率降低（圖3f-h）。說(shuō)明ZmABF4對玉米抗旱性具有正向調控作用，?ZmABF4^CIMBL55可能是玉米抗旱性的優(yōu)異等位基因。

圖3?遺傳變異的鑒定及其與抗旱性的關(guān)系

4.表觀(guān)遺傳變異對抗旱性的影響

對B73、Mo17和CIMBL55三個(gè)材料進(jìn)行全基因組亞硫酸氫鹽測序(BS-seq)，準確評估其基因組的DNA甲基化狀態(tài)。mCG和mCHG的甲基化水平在全基因組中較高，但在基因邊界處明顯下降。相比之下，包括RNA-TE區域在內的基因組中mCHH水平普遍較低，而DNA-TE元件中mCHH水平較高，表明在這兩種類(lèi)型的TEs中，CHH甲基化的調控機制不同。

基于CIMBL55和B73基因組序列，鑒定SV相關(guān)基因組區域的差異DNA甲基化。在CIMBL55中鑒定到5,346個(gè)插入序列用于SV相關(guān)DNA甲基化分析。根據mCG、mCHG和mCHH的水平，將插入序列的DNA甲基化模式聚類(lèi)為5組（圖4a-c）。其中cluster?4插入片段的mCG、mCHG和mCHH水平明顯高于側翼序列（圖4b, c）。并且鄰近基因的轉錄起始位點(diǎn)的插入序列具有顯著(zhù)高的CHH甲基化水平，富集了大量的DTH (DNA Transposon terminal inverted repeat Harbinger)類(lèi)轉座子（圖4b）。

在ZmNAC075的啟動(dòng)子區域發(fā)現了差異DNA甲基化。CIMBL55和B73的基因組序列比較發(fā)現，在ZmNAC075^B73的上游區域有兩個(gè)插入序列，具有較高的甲基化狀態(tài)。此外，攜帶ZmNAC075^B73等位基因的種質(zhì)在干旱脅迫下的基因表達水平和幼苗存活率明顯低于攜帶ZmNAC075^CIMBL55等位基因的種質(zhì)（圖4e,f）。CRISPR靶向基因敲除結合全基因組BS-seq分析顯示，發(fā)現兩個(gè)插入序列的CHH高甲基化狀態(tài)可能抑制基因表達進(jìn)而影響抗旱性（圖4l）。

圖4?與SV相關(guān)的DNA甲基化狀態(tài)

5.ZmRtn16可以顯著(zhù)提高玉米的抗旱性

另外，基因組結構變異分析發(fā)現CIMBL55中ZmRtn16的3′-UTR區域缺少一個(gè)28bp的插入序列，該變異與干旱脅迫后的幼苗存活率密切相關(guān)（圖5d）。表型分析發(fā)現，該變異影響基因表達和抗旱性（圖5e, f）。分別從B73和CIMBL55中克隆了3’-UTR序列（包含一個(gè)先前確定的顯著(zhù)SNP和28 bp的SV）。分析發(fā)現28 bp的插入有利于增強ZmRtn16的表達豐度，而SNP對其沒(méi)有影響。

進(jìn)一步構建ZmRtn16過(guò)表達轉基因株系，發(fā)現其比WT具有更好的抗旱性（圖5h）。而兩個(gè)CRISPR基因敲除株系中抗旱性較差（圖5i）。過(guò)表達株系葉片失水率較低，葉片氣孔??；而KO株系葉片失水率較高，葉片氣孔更大（圖5h-i）；表明過(guò)表達株系的抗旱性與氣孔大小相關(guān)。比較ZmRtn16-OE、zmrtn16-crispr和WT株系的表型，發(fā)現在干旱條件下，ZmRtn16-OE的抗旱性更好（圖5j）。以上結果表明ZmRtn16在植物抗旱性中發(fā)揮了積極作用。

圖5?ZmRtn16顯著(zhù)提高玉米的抗旱性

為了解ZmRtn16的生物學(xué)功能，亞細胞定位分析發(fā)現ER標志物與ZmRtn16-GFP融合蛋白共定位在ER中，表明ZmRtn16-GFP在ER中發(fā)揮作用。免疫共沉淀(co-IP)顯示ZmRtn16能與液泡膜H⁺-ATPase復合體A (ZmVHA-A)和E3亞基?(ZmVHA-E3)相互作用。隨后，通過(guò)比較zmrtn16-crispr和WT株系的ZmVHA-A和ZmVHA-E3亞細胞定位，發(fā)現ZmRtn16可以促進(jìn)ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡膜定位（圖6c）。此外，與WT植物相比，ZmRtn16-OE株系液泡質(zhì)子泵活性較高，而ZmRtn16-KO株系液泡質(zhì)子泵活性較低（圖6e），突出了液泡質(zhì)子泵在抗旱性上的作用。綜上所述， CIMBL55基因組中ZmRtn16基因3′ -UTR中28 bp缺失，可能增強ZmRtn16的表達，促進(jìn)了ZmVHA-A和ZmVHA-E3在液泡膜中的定位，從而提高玉米的抗旱性。

圖6?ZmRtn16與ZmVHA-A和E3相互作用

總結

本研究構建了一個(gè)高質(zhì)量的抗旱玉米種質(zhì)CIMBL55的基因組。結合已發(fā)表的30個(gè)玉米自交系基因組在泛基因組水平上進(jìn)行遺傳變異分析，在108個(gè)先前鑒定的抗旱基因中，CIMBL55中至少攜帶了65個(gè)優(yōu)異等位變異，這可能是構成CIMBL55優(yōu)良抗旱性的遺傳基礎。值得注意的是，編碼一種網(wǎng)狀樣蛋白（reticulon-like protein）的ZmRtn16通過(guò)促進(jìn)液泡H⁺– ATPase活性來(lái)增強抗旱性，突出了液泡質(zhì)子泵在玉米抗旱性中的作用?？傊?，?CIMBL55基因組的組裝為玉米抗旱性的遺傳解析和改良提供了基礎，為我國和全球的糧食安全提供了支持。