在科研工作中，您是否遇到過(guò)以下問(wèn)題？
我想做單細胞測序，但是樣品在野外采摘，只能凍存或干燥保存，難以用新鮮組織開(kāi)展單細胞轉錄組。
聽(tīng)說(shuō)做單細胞測序需要制備原生質(zhì)體，實(shí)驗室嘗試很久都無(wú)法成功制備原生質(zhì)體。
制備原生質(zhì)體過(guò)程需要酶消化且制備時(shí)間很長(cháng)，可能會(huì )觸發(fā)應激反應，影響轉錄表達的真實(shí)結果。
我的樣本部分細胞直徑大于40 μm，無(wú)法被市面上大部分的儀器平臺捕獲。
為了有效解決植物單細胞目前研究的桎梏，單細胞核轉錄組測序（single-nuclei RNA sequencing，snRNA-seq）應運而生。它是指通過(guò)提取細胞核，從而在單細胞水平研究基因表達的技術(shù)。
技術(shù)原理
單細胞核轉錄組測序技術(shù)（snRNA-seq）不同于常規的單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），不需要進(jìn)行原生質(zhì)體的制備，而是對組織進(jìn)行切割/研磨破碎。之后利用百邁客優(yōu)化細胞核分離試劑盒提取，清洗和重懸；再通過(guò)10x genomics單細胞測序平臺利用微流控、油滴包裹和barcode標記等技術(shù)來(lái)實(shí)現高通量的單細胞核捕獲，構建單細胞核轉錄組文庫，借助Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細胞核的基因表達數據，從而實(shí)現復雜組織或珍貴冷凍樣本在單細胞水平進(jìn)行基因表達測序。
圖1 番茄莖尖核提取流程及核形態(tài)展示（Tian C et al. 2020）
技術(shù)優(yōu)勢
1. 操作性強：無(wú)需制備原生質(zhì)體，提高實(shí)驗效率，縮短實(shí)驗周期。
2. 更少干擾：避免原生質(zhì)體制備過(guò)程誘導應激基因表達，減少“轉錄偏好”。
3. 輕松取材：可以實(shí)現凍存樣品研究，樣品保存和運輸更便捷！
4. 結果可靠：基因檢出率、細胞分群的結果與scRNA-seq趨于一致。
5. 兼容性強：可以開(kāi)展更大尺寸的細胞研究，避免丟失重要信息。
應用案例
案例一
題目：玉米單核RNA測序揭示調控氣孔運動(dòng)和發(fā)育的信號網(wǎng)絡(luò )
期刊：The Plant Cell?[IF: 12.085]?2022.2.15
發(fā)表單位：河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
樣本設計：玉米葉基（n=1）、玉米果皮snRNAseq（n=3）、WT（n=4）和bzu2-1突變體（n=3）玉米葉bulk RNA-seq
主要研究結果：
圖2 玉米果皮snRNA-seq數據中的細胞類(lèi)型鑒定
案例二
題目：基于單核轉錄組數據空間重建的擬南芥花分生組織3D基因表達圖譜
期刊：Nature?Communication?[IF: 17.694]?2022.5.20
發(fā)表單位：柏林洪堡大學(xué)生物學(xué)研究所
樣本設計：擬南芥花序發(fā)育的第5階段（DEX誘導后4天）、第4階段（DEX誘導后3天）的花分生組織snRNA-seq以及FANS分選AP3-(n=3)、AG-(n=3)樣本的細胞核進(jìn)行bulk RNA-seq
單細胞轉錄組學(xué)以分辨率表征發(fā)育器官中的基因表達異質(zhì)性。然而，在這種方法中，細胞的原始物理位置丟失了。在植物中，恢復發(fā)育器官中細胞的原始位置是將基因活性與細胞特性和功能聯(lián)系起來(lái)的關(guān)鍵。本研究從擬南芥花分生組織的7,716個(gè)細胞核中鑒定出12個(gè)主要的細胞類(lèi)型。之后將單核轉錄組數據與基于顯微復制的三維空間重建，重建了三維花分生組織中單個(gè)細胞的全基因組基因表達模式，展現了空間重建的3D單細胞轉錄組圖譜在理解植物形態(tài)建成方面的能力。
圖3 擬南芥花分生組織的單核RNA測序
總 結
與單細胞轉錄組相比，植物單細胞核轉錄組在保證高效捕獲分選單細胞數據的同時(shí)，減少了應激基因表達影響、胞質(zhì)內代謝物的干擾。并可兼容更大細胞直徑，獲得更全面信息。也為特殊樣本進(jìn)行單細胞測序提供了新的解決方案，為進(jìn)一步推動(dòng)植物單細胞研究提供重要的技術(shù)支撐。
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參考文獻
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Tian C, Du Q, Xu M, et al.?Single-Nucleus RNA-seq Resolves Spatiotemporal Developmental Trajectories in the Tomato Shoot Apex.2020.?BioRxiv: 2020-2029
Sun G, Xia M, Li J, et al. The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata. Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1890-1911.
Neumann M, Xu X, Smaczniak C, et al. A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data. Nat Commun. 2022 May 20;13(1):2838.
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