蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應用

當前蛋白質(zhì)組學(xué)已成為21世紀生物醫學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)等研究領(lǐng)域最活躍的熱點(diǎn)之一，其理論和方法在植物學(xué)科中的應用方興未艾，已滲透到植物遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、植物發(fā)育生物學(xué)、植物生態(tài)學(xué)、植物共生生物學(xué)和植物病理學(xué)等諸多領(lǐng)域，為農學(xué)、林學(xué)、畜牧學(xué)和水產(chǎn)學(xué)等相關(guān)農業(yè)生物科學(xué)領(lǐng)域的研究注入了新的活力。在農業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在作物遺傳育種，作物逆境脅迫應答，作物品質(zhì)改良和農作物-微生物相互作用等領(lǐng)域的研究中得到了廣泛應用。

蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應用案例一

中文標題：比較非標記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了N-連接糖鏈通過(guò)調節蛋白豐度對擬南芥耐鹽性起到的關(guān)鍵作用

研究對象：擬南芥幼苗

發(fā)表期刊：Frontiers?in?Plant?Science

運用技術(shù)：非標記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)

研究背景

作為固著(zhù)生物，陸地植物經(jīng)常遭受各種壓力和不利環(huán)境，例如極端溫度、干旱和高鹽度。在農業(yè)生產(chǎn)中，高鹽分影響自然界作物的地理分布，造成大量的產(chǎn)量損失。許多研究表明，多種基因和/或代謝途徑在植物的非生物脅迫反應中發(fā)揮協(xié)同作用，很難通過(guò)調節單一有效基因或蛋白質(zhì)來(lái)顯著(zhù)提高植物對外界脅迫的抵抗力。

在植物中，N-糖基化參與許多生物過(guò)程，包括類(lèi)固醇激素受體的?ER?質(zhì)量控制、配子體識別,?亞細胞轉運,?植物先天免疫?和氣孔發(fā)育等，主要是通過(guò)調節底物蛋白的穩定性、功能或亞定位實(shí)現調控過(guò)程。此外研究發(fā)現復雜的N-聚糖生物合成失敗會(huì )導致擬南芥幼苗對鹽敏感，但對其潛在的分子機制仍知之甚少。本文利用納升流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜?(nanoLC-MS/MS)?技術(shù)進(jìn)行了無(wú)標記蛋白質(zhì)組學(xué)分析，比較分析了野生型?(WT)?和兩個(gè)抗鹽脅迫的突變體的蛋白質(zhì)組差異。

研究流程

研究結果

從632個(gè)多肽中共鑒定出727個(gè)糖基化位點(diǎn)，對應于371個(gè)糖蛋白。大多數?N-糖基化位點(diǎn)表現出典型的NXS/T基序序列。鑒定出的?N-糖蛋白的數量因樣品而異。在對照組中，在mns1?mns2中鑒定出311個(gè)糖蛋白，在cgl1-3突變體中鑒定出300個(gè)糖蛋白，而在WT中僅鑒定出203個(gè)。在WT中，減少的N-糖蛋白可能是因為攜帶復雜N-聚糖的糖蛋白的富集程度低于突變體中具有高甘露糖型?N-聚糖的糖蛋白。然而，在高鹽度存在的情況下，WT中檢測到的糖蛋白數量略有增加（從203到244），但在mns1mns2（從311到297）和cgl1-3（從300到263；圖1）中出現減少。一種可能性是響應鹽脅迫的糖蛋白的豐度受到附著(zhù)的N-聚糖的調節，N-聚糖的欠成熟使鹽脅迫條件下相關(guān)的糖蛋白不穩定，這與之前的研究一致，即N-聚糖的成熟對植物耐受鹽脅迫至關(guān)重要。

文中進(jìn)一步分析了鹽脅迫下DAG在GO注釋和KEGG代謝途徑中的生物學(xué)功能。在兩個(gè)突變體中觀(guān)察到更多減少的糖蛋白，尤其是在cgl1-3中（圖2?A–C）。值得注意的是，與?WT?相比，?mns1?mns2和cgl1-3突變體中的水解酶均得到富集（圖2?D–F）。在鹽脅迫下，WT和兩個(gè)參與內質(zhì)網(wǎng)聚糖鏈轉移的突變體中?STT3A（OST亞基）、紫色酸性磷酸酶?2（PAP2）和類(lèi)胚蛋白10（GLP10）的豐度發(fā)生了變化，這些蛋白分別參與了根系生長(cháng)和碳代謝（圖2?D）。STT3A在?WT中增加，但在mns1?mns2和cgl1-3中減少；PAP2?在?WT?和mns1mns2中增加，但在cgl1-3中減少，并且GLP10在所有三個(gè)樣本中都增加。進(jìn)一步的分子功能分析發(fā)現，與WT相比，水解酶活性在mns1?mns2和cgl1-3中富集（圖2?E,G）。WT中鑒定的蛋白質(zhì)的生物學(xué)過(guò)程多與應激反應相關(guān)，而來(lái)自突變體的大多數DAG與碳水化合物代謝過(guò)程有關(guān)（圖3?G）。這些結果表明，mns1?mns2和cgl1-3突變體中的鹽響應糖蛋白不能正確響應壓力，這可能是由于缺乏正確的N-聚糖修飾，導致它們的亞細胞定位異常。

研究結論

許多證據表明，植物對鹽脅迫的適應性反應需要相關(guān)蛋白上加工成熟的N-聚糖參與。然而，關(guān)于在這個(gè)過(guò)程中起作用的鹽響應糖蛋白知之甚少。本研究鑒定了野生型?(WT)擬南芥中的鹽響應糖蛋白和兩個(gè)N-聚糖成熟缺陷的突變體mns1?mns2和cgl1。通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜?(LC-MS/MS)?進(jìn)行定量分析，共鑒定出97種豐度變化?>?1.5?的蛋白質(zhì)對抗鹽脅迫。表明N-聚糖對于調節應激反應蛋白水平至關(guān)重要，并且列出了幾種負責擬南芥耐鹽脅迫的新型糖蛋白。

蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究中的應用案例二

中文標題：通過(guò)非標記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示菊芋（Helianthus?tuberosus?L.）塊莖蛋白質(zhì)組

研究對象：菊芋塊莖

期刊：Molecules

運用技術(shù)：非標記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景Helianthus?tuberosus?L.，俗稱(chēng)菊芋（簡(jiǎn)稱(chēng)JA），是向日葵科菊科（菊科）的一年生草本植物。這種植物以其對環(huán)境壓力的抵抗力而聞名，并且在不同的土壤（干旱-鹽堿）和溫度（冷-熱）條件下茁壯成長(cháng)，這使它在世界大部分地區都有種植。除此之外，該植物還因其在原料、功能性食品、生物質(zhì)、生物醫學(xué)和化學(xué)工業(yè)中的重要性而聞名。該研究小組一直致力于將菊芋塊莖作為日常生活中的傳統/替代藥物進(jìn)行栽培和利用，并研究降低人體受試者的血糖水平、HbA1c等。了解塊莖的蛋白質(zhì)成分可能會(huì )揭示其愈合特性，尤其是與糖尿病有關(guān)的特性。本文使用三種商業(yè)加工的JA塊莖產(chǎn)品（干粉和干片）進(jìn)行了非標記label?free定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

研究技術(shù)流程

研究結果

無(wú)標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于分析三個(gè)塊莖樣品之間的差異蛋白質(zhì)豐度。去除污染物和低置信度蛋白后，共鑒定出2967個(gè)高置信度蛋白組（圖1?A）。由于使用了三種不同的塊莖樣品，在MS運行后預計會(huì )出現多個(gè)缺失值；因此，在三個(gè)重復中的兩個(gè)（2102個(gè)蛋白質(zhì)組）中可重復鑒定的蛋白質(zhì)組被選擇并考慮進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖1?A）。

維恩圖分析顯示1702個(gè)蛋白質(zhì)組通常在所有三個(gè)塊莖樣品中鑒定，而89、36和54個(gè)蛋白質(zhì)組分別僅在塊莖?1、2和3中鑒定。此外，塊莖?1?和塊莖?2?共有?112?個(gè)蛋白質(zhì)組，表明它們的蛋白質(zhì)組與塊莖對?(2,3)?和?(3,1)?相比更密切相關(guān)（圖1?B）。為了檢查同一樣品一式三份中無(wú)標記蛋白質(zhì)定量的重現性，使用?Perseus軟件生成多散點(diǎn)圖（圖1?C）。相同樣本的散點(diǎn)圖顯示出典型的非均勻分布，即在較低強度時(shí)較寬，在較高強度時(shí)指向較高。同一樣品的不同重復的皮爾遜相關(guān)系數大于0.944，表明同一樣品的三次重復之間具有高度相關(guān)性。直方圖顯示了缺失值插補前后的蛋白質(zhì)計數?(圖1?D)。

層次聚類(lèi)分析將差異蛋白分成四個(gè)簇，每個(gè)簇都有不同的表達譜（圖2?A）。簇1包含61種蛋白質(zhì)，在塊莖3中主要下調，而簇1的891種蛋白質(zhì)主要在塊莖2中上調。簇3顯示塊莖3中豐度增加的379種蛋白質(zhì)，而簇4中的771種蛋白質(zhì)在塊莖?1?中顯示最大豐度。顯示前48種差異調節蛋白質(zhì)豐度模式的熱圖位于?(圖2?B）。在這48個(gè)DEs中鑒定了多種具有獨特功能的蛋白質(zhì)。共有19、24和34種DE蛋白受到高度調節，而塊莖1-3中分別有27、22和14種蛋白質(zhì)降低。結果表明，塊莖?1?和塊?3?的蛋白質(zhì)含量非常不同，而塊莖2的結果則參差不齊。此外，偏最小二乘判別分析?(PLS-DA)?將成分?1?中的塊莖1和3分開(kāi)，占總方差的32.7%，而成分2中的塊莖2與塊莖1和3分開(kāi)，占總方差的?25.5%總方差的百分比?(圖2?C）。最后確定了有助于PLS-DA圖分離的前15種蛋白質(zhì)（圖2?D)。

統計分析后，作者進(jìn)行基于基因本體（GO）的功能分類(lèi)，在2102種蛋白質(zhì)中，PANTHER?19.0?針對Helianthus?annus數據庫檢測到2044種蛋白質(zhì)。接下來(lái)，進(jìn)行?PANTHER?通路分析以對蛋白質(zhì)通路進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現了大多數蛋白質(zhì)歸因于泛素蛋白體和核苷酸（嘌呤）生物合成途徑，其次是TCA循環(huán)、糖酵解、丙酮酸代謝、細胞周期和嘧啶核糖核苷酸途徑。

本文還確定了幾種直接或間接參與各種疾病相關(guān)機制的蛋白質(zhì)。三種蛋白質(zhì)命中被確定與阿爾茨海默病相關(guān)，并發(fā)現?11?個(gè)蛋白質(zhì)屬于亨廷頓病通路。除此以外，作者還確定了眾所周知的具有治療意義的蛋白質(zhì)，當作為膳食蛋白質(zhì)來(lái)源或通過(guò)口服補充劑食用時(shí)，這些主要用于治療糖尿病和癌癥等慢性疾病。還鑒定了一些抗微生物蛋白（圖3）。

研究結論

本文使用基于高通量無(wú)標記LC-MS/MS的組學(xué)技術(shù)對來(lái)自?xún)煞N不同菊芋加工技術(shù)，包括干粉（塊莖?1?和?2）和干片（塊莖?3）的塊莖蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。鑒定出的蛋白質(zhì)及其分類(lèi)表明了支持了先前的研究數據（尚未發(fā)表）的功能：數據表明菊芋對血糖水平有降低作用，以及與人類(lèi)糖化血紅蛋白?(Hb-A1c)?的關(guān)系，預防老年癡呆以及治療亨廷頓病等功效。