眾所周知基因的表達是十分復雜的調控網(wǎng)絡(luò )，除了轉錄調控和表觀(guān)修飾的調控機理，轉錄后還有許多復雜的調控機制，比如目前相對比較成熟的非編碼RNA的研究?jì)热??；诙鷾y序技術(shù)的全轉錄組測序研究，同時(shí)分析同一樣本中的mRNA，lncRNA，circRNA和miRNA，并且通過(guò)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò )分析和ceRNA網(wǎng)絡(luò )分析，使研究?jì)热莞酉到y化，致力于深入挖掘生命現象背后的轉錄調控問(wèn)題。ceRNA網(wǎng)絡(luò )是全轉錄組分析的核心，有助于縮小篩選范圍，挖掘關(guān)鍵基因。ceRNA（即競爭性?xún)仍碦NA）由Pandolfi等人于2011年提出，是指所有類(lèi)型的RNA都可以通過(guò)microRNA應答元件進(jìn)行相互作用。ceRNA可以通過(guò)競爭性的結合miRNA來(lái)調控彼此的表達，如：miRNA可以導致基因沉默，而lncRNA競爭性結合了miRNA，從而影響了miRNA導致基因沉默這一功能。這里，mRNA、lncRNA、circRNA等均可作為ceRNA。
全轉錄組測序文庫構建及分析內容
ceRNA整合分析、全轉錄組研究思路
全轉錄組分析思路：①單一RNA的標準分析，lncRNA，circRNA，mRNA和miRNA鑒定和注釋?zhuān)町惐磉_和序列特征分析，對于mRNA直接進(jìn)行差異基因功能注釋和富集分析，對于差異非編碼RNA則對其預測的靶基因或來(lái)源基因（circRNA來(lái)源基因）進(jìn)行功能注釋和富集分析；②每種RNA單獨分析后,把所有RNA整合在一起進(jìn)行ceRNA整合分析，可以?xún)蓛砷g，三者之間以及四種RNA的聯(lián)合分析，多層面、多角度全面闡述生物學(xué)問(wèn)題。
總而言之，與單一的mRNA研究相比，全轉錄組研究可同一批樣本獲得2種文庫，分析4種RNA，節省送樣量；項目性?xún)r(jià)比高，易發(fā)高分文章；縮小差異基因范圍，減少傳統驗證實(shí)驗工作量。接下來(lái)小編以非編碼RNA對小鼠黑色素細胞發(fā)育調控作用為例，給大家分享一篇單一lncRNA分析和一篇全轉錄組聯(lián)合分析文章，以闡明全轉錄的優(yōu)勢。
成功案例一
英文標題：Differential Expression of lncRNAs and predicted target genes in normal mouse melanocytes and B16 cells
中文標題：lncRNA及其靶基因在正常小鼠黑素細胞和B16細胞中的差異表達
發(fā)表雜志：Experimental dermatology.2018
影響因子：3.96
合作單位：山西農業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與獸醫學(xué)院
材料：C57BL-6J小鼠皮膚正常黑素細胞，C57BL-6J小鼠B16黑色素瘤細胞
方法：Illumina HiSeq；lncRNA seq
主要研究結果：
1. lncRNA的鑒定和差異分析，使用四種計算方法，發(fā)現2319個(gè)lncRNAs在正常黑素細胞和B16細胞中均表達，其中373個(gè)在顯著(zhù)水平上差異表達。對前6個(gè)差異表達的lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證，結果顯示測序數據中表達趨勢相同。
2. 通過(guò)靶基因預測，發(fā)現367個(gè)差異表達lncRNAs的靶基因，KEGG分析顯示，211個(gè)已知基因是Wnt信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、黑色素瘤和其他幾種癌癥相關(guān)調節通路中的靶基因。其中，43個(gè)lncRNA和靶基因與黑素發(fā)生和黑素瘤途徑相關(guān)。
3. lncRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現在差異表達的lncRNAs中，lnc-13317.1通過(guò)靶向BRCA1，且原位雜交顯示BRCA1 mRNA在B16細胞質(zhì)中表達，預測BRCA1在黑色素瘤細胞周期中發(fā)揮作用。
成功案例二
英文標題：The comprehensive detection of miRNA, lncRNA, and circRNA in regulation of mouse melanocyte and skin development
中文標題：綜合檢測miRNA、lncRNA和circRNA對小鼠黑素細胞和皮膚發(fā)育的調控作用
發(fā)表雜志：Biological research .2020
影響因子：5.612
合作單位：山西農業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
材料：C57BL/6J和ICR小鼠，分別取胚胎15天和出生7天的皮膚樣本，每組3個(gè)生物學(xué)重
方法：Illumina HiSeq；全轉錄組測序
主要研究結果：
1. miRNA、lncRNA和circRNA鑒定和差異分析：鑒定出了206種和183種不同表達的miRNA, 600種和800種不同表達的lncRNA，以及50種和54種不同表達的circRNA。
2. 差異非編碼RNA靶基因預測：GO term和pathway分析差異表達miRNA、lncRNA的靶基因以及circRNA的宿主基因，結果顯示circRNA的宿主基因主要富集在細胞過(guò)程和單個(gè)生物體過(guò)程中；miRNA的靶基因主要富集于染色質(zhì)結合和核內鈣離子結合；lncRNA相關(guān)基因的功能是翻譯后修飾。
3. ceRNA網(wǎng)絡(luò )分析：lncRNA和circRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò )顯示了ncRNA與皮膚發(fā)育和黑素細胞發(fā)育相關(guān)的mRNA之間復雜的相互作用，如與黑色素細胞發(fā)育相關(guān)的Tcf4、Gnas和Gpnms。
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