百邁客生物與廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所合作，兩年(2020-2021)連發(fā)3篇文章，影響因子總計13.934，文章結合藥敏試驗、細菌完成圖測序、MLST分型和比較基因組學(xué)等分析，深度解析了多重耐藥菌克雷伯氏菌和奇異變形桿菌的耐藥機制和可能的傳播途徑，對于未來(lái)探索細菌抗性基因的傳播擴散機制具有重要意義。
在恭喜老師論文發(fā)表的同時(shí)，我們對文章進(jìn)行了解讀，分享給各位讀者，本期分享的為細菌基因組成功案例，希望能夠為各位老師提供研究思路。
成功案例一：中國紅袋鼠超廣譜β-內酰胺酶多重耐藥肺炎克雷伯菌的特征及流行病學(xué)研究
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：5.640
發(fā)表時(shí)間：2020年10月
合作單位：廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所
研究方法：全基因組測序(ONT)，藥敏試驗，質(zhì)粒接合與轉化實(shí)驗，MLST分型
研究?jì)热?/strong>
β-內酰胺酶的耐藥性對公共衛生構成了嚴重的挑戰。產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌克隆的報道越來(lái)越多。人們對動(dòng)物園中耐藥菌株的流行率和生物學(xué)特征知之甚少。在鄭州動(dòng)物園的常規監測中，研究者在健康紅袋鼠(Macropus Rufus)體內發(fā)現了嚴重多重耐藥肺炎克雷伯菌。研究者從紅袋鼠中分離出1株多重耐藥肺炎克雷伯菌，通過(guò)全基因組測序表明菌株染色體基因組Chr-M297-1攜帶blaDHA-3、blaSHV-1、blaCTX-M-14等抗性基因；pM297-1.1攜帶blaCTX-M-14、blaTEM-191等9個(gè)抗性基因；pM297-1.2攜帶blaTEM–1、blaCTX–M–3等22個(gè)抗性基因?？勺匪菪苑治霰砻?，這兩個(gè)質(zhì)粒與從中國四川省南部一些城市的人類(lèi)臨床樣本中提取的質(zhì)粒高度相似(>99%)，表明這些質(zhì)粒在中國正在傳播。此外，通過(guò)E. coli J53接合試驗表明兩個(gè)攜帶接合轉移基因的質(zhì)粒通過(guò)接合促進(jìn)了抗菌基因的傳遞。該研究表明，產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的傳播和適應發(fā)生在動(dòng)物園環(huán)境中，動(dòng)物園可能成為臨床重要耐藥基因的重要潛在儲存庫。因此，有必要監測動(dòng)物園環(huán)境下圈養野生動(dòng)物中耐藥基因株的出現和傳播情況。
圖1.多重耐藥肺炎克雷伯氏菌M297-1分離株質(zhì)粒中的抗生素抗性基因、插入序列和復合轉座子結構特點(diǎn)。
(A)pM297-1.1與其同源質(zhì)粒MDR區域特性及比較；(B)pM297-1.2與其同源質(zhì)粒MDR區域特性及比較。
成功案例二：克雷伯氏菌多復制子抗性質(zhì)粒介導廣泛抗性基因傳播
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：5.640
發(fā)表時(shí)間：2021年10月
合作單位：廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所
研究方法：全基因組測序(ONT)，多重耐藥表型評估，比較基因組分析
研究?jì)热?/strong>
多復制子耐藥質(zhì)粒已成為革蘭氏陰性菌耐藥基因的重要載體，但多復制子質(zhì)粒的進(jìn)化尚不清楚。該研究采用微量肉湯稀釋法對2018年至2020年從不同野生動(dòng)物和環(huán)境中分離到的56株克雷伯氏菌進(jìn)行了表型鑒定，并對其進(jìn)行了測序和分析，以進(jìn)行細菌全基因組關(guān)聯(lián)研究。結果表明，非人類(lèi)來(lái)源的菌株對氨芐西林的耐藥率較高(80.36%)，且耐藥范圍較廣。馬來(lái)亞穿山甲分離株對頭孢類(lèi)抗生素高度耐受，同時(shí)對氯霉素、左氧氟沙星和復方新諾明等藥物耐受?；蚪M分析表明，這些菌株的抗性質(zhì)粒攜帶多種抗生素耐藥基因。進(jìn)一步對69個(gè)質(zhì)粒序列分析表明，28個(gè)質(zhì)粒為多復制子質(zhì)粒，主要攜帶blaCTX-M-15、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaOXA-1和blaTEM-1等β-內酰胺酶基因。對不同分離株攜帶的質(zhì)粒分析表明，Klebsiella pneumoniae可能是一種重要的多復制子質(zhì)粒宿主。質(zhì)粒骨架和結構分析表明，多拷貝質(zhì)粒是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的單個(gè)質(zhì)粒融合而成，對抗生素環(huán)境具有很強的適應性，不斷增強耐藥菌株在世界范圍內傳播的能力。綜上所述，多復制子質(zhì)粒比非復制子質(zhì)粒能夠更好地攜帶抗性基因，這可能是細菌對高抗生素壓力環(huán)境反應的重要機制。該研究對于未來(lái)探索細菌抗性基因的傳播擴散機制具有重要意義。
圖2.基于16S rRNA序列的系統發(fā)育樹(shù)的構建。
內環(huán)1：分離物種；內環(huán)2：菌種；內環(huán)3：攜帶質(zhì)粒的菌株；外環(huán)：攜帶β-內酰胺類(lèi)耐藥基因和氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的質(zhì)粒。
成功案例三：從中國野生動(dòng)物分離的多重耐藥奇異變形桿菌：增加公共衛生風(fēng)險
期刊：Integrative Zoology
影響因子：2.654
發(fā)表時(shí)間：2021年7月
合作單位：廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所
研究方法：全基因組測序(ONT)，耐藥基因分析
研究?jì)热?/strong>
奇異變形桿菌(Proteus Mirabilis)臨床分離株出現多重耐藥(MDR)是一個(gè)日益嚴重的公共衛生問(wèn)題，并對野生動(dòng)物造成嚴重影響。作者從12個(gè)不同物種中分離鑒定了54株奇異變形桿菌（P. mirabili）。藥敏結果表明25株為多重耐藥菌株。采用全基因組測序方法對10株分離株進(jìn)行比較基因組分析。結果表明，奇異變形桿菌主要攜帶碳青霉烯類(lèi)耐藥基因blaOXA-1、blaNDM-1和blaTEM-1。TN21、TN7和SXT/R391移動(dòng)元件導致這些耐藥基因的廣泛傳播。綜上所述，從野生動(dòng)物分離的P.mirabilis對臨床常用藥物的耐藥性高于從人類(lèi)分離的。因此，攜帶MDR臨床分離株的野生動(dòng)物應引起公共衛生部門(mén)的重視。
圖3.抗生素抗性基因的傳播循環(huán)架構:涉及人類(lèi)、動(dòng)物和環(huán)境的多個(gè)方面。
總結
通過(guò)以上三篇文章，我們可以發(fā)現，菌株耐藥性研究，一般流程為：1）菌株分離；2）藥敏試驗；3）細菌基因組測序；4）耐藥基因分析；5）比較基因組分析；通過(guò)三代測序（Nanopore/PacBio）可獲得細菌基因組的完整序列，進(jìn)而可在基因組層面深入研究菌株耐藥基因與傳播機制。
以上論文的測序和部分數據分析工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。如您有任何疑問(wèn)，歡迎討論區留言或者發(fā)郵件給我們（郵箱地址：tech@biomarker.com.cn）
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參考文獻：
1. Wang X, Zhao J, Ji F, et al. Multiple-Replicon Resistance Plasmids of Klebsiella Mediate Extensive Dissemination of Antimicrobial Genes[J]. Frontiers in microbiology, 2021: 3159.
2. Wang X, Zhao J, Ji F, et al. Multiple-Replicon Resistance Plasmids of Klebsiella Mediate Extensive Dissemination of Antimicrobial Genes[J]. Frontiers in microbiology, 2021: 3159.
3. Kang Q, Wang X, Zhao J, et al. Multidrug‐resistant Proteus mirabilis isolates carrying blaOXA‐1 and blaNDM‐1 from wildlife in China: increasing public health risk[J]. Integrative Zoology, 2021, 16(6): 798-809.
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