[文獻解讀]-全轉錄組RNA測序對急性髓系白血病的綜合診斷

百邁客一直秉承“生物科技長(cháng)信，服務(wù)社會(huì )，造福人民”的企業(yè)使命，致力于讓生物科技更快，更好的提高人類(lèi)生活質(zhì)量。通過(guò)整合高通量測序技術(shù)、生物信息技術(shù)與云計算、大數據等新興IT技術(shù)，為用戶(hù)開(kāi)啟生物科技服務(wù)2.0新時(shí)代。各個(gè)測序的經(jīng)驗也都是十分豐富，今天給大家帶來(lái)一篇全轉錄組對白血病治療輔助的研究報道，了解應用的新方向。詳解見(jiàn)下文：

英文題目：Comprehensive diagnostics of acute myeloid leukemia by whole transcriptome RNA sequencing

中文題目：全轉錄組RNA測序對急性髓系白血病的綜合診斷

期刊：Leukemia

影響因子：11.528

發(fā)表日期：2020.3.3

摘要

急性髓細胞白血病(AML)是由基因變異引起的，基因變異也控制著(zhù)患者的預后，并指導風(fēng)險適應和靶向治療。急性髓系白血病的遺傳變異在結構上是多樣的，目前通過(guò)不同的診斷分析來(lái)檢測。本研究旨在建立全轉錄組核糖核酸測序作為AML診斷的單一、全面和靈活的平臺。我們開(kāi)發(fā)了HAMLET(人類(lèi)急性髓細胞白血病快速轉錄組學(xué))作為生物信息學(xué)管道，用于同時(shí)檢測fusion genes、small variants、tandem duplications和gene expression，所有信息都集中在一個(gè)被注釋的、簡(jiǎn)易的輸出文件中。對100例急性髓系白血病患者進(jìn)行了全轉錄組RNA測序，并通過(guò)reference assays和targeted resequencing驗證了HAMLET結果。數據顯示，HAMLET z確地檢測到所有融合基因和過(guò)表達EVI1與3q26突變無(wú)關(guān)。此外，AML中經(jīng)常突變的13個(gè)基因的small variants有99.2%的敏感性和100%的特異性，以及FLT3和KMT2A的tandem duplications以100%的靈敏度和97.1%的特異性通過(guò)了新算法檢測?？傊?，HAMLET有潛力成為在單一技術(shù)平臺上提供與AML分類(lèi)、風(fēng)險評估和靶向治療相關(guān)的z確全面的診斷信息的平臺。

背景介紹

急性髓系白血病(AML)是由功能互補的基因突變引起的，這些突變導致髓系前體細胞不斷增殖和成熟被抑制。顯性 AML 平均攜帶13個(gè)非同義突變。造血干細胞中AML起始突變的獲得可能比AML診斷早幾十年。2016版的WHO classification of hematologic malignancies區分臨床和預后重要性的九種AML亞型。在50-55%的AML病例中進(jìn)行對遺傳變異的風(fēng)險評估的z確分類(lèi)，并可能指導靶向治療。在80-85%的AML病例對重復突變基因的擴展組的基因組進(jìn)行分類(lèi)。

然而，急性髓細胞白血病的z確分類(lèi)需要不同的技術(shù)來(lái)捕獲結構多樣的基因突變，如較大的插入和缺失(indels)、融合基因和除小變異外的結構性染色體變異。此外，結構正?；虻谋磉_水平可對預后產(chǎn)生決定性影響。因此，在當前的技術(shù)平臺下，急性髓細胞白血病診斷及風(fēng)險評估仍然繁瑣、貴，且不完整。為了解決這一需求，我們實(shí)施了全轉錄組RNA測序(mRNAseq)，作為獲取與當前和未來(lái)分類(lèi)和風(fēng)險分類(lèi)相關(guān)的所有遺傳信息的單一平臺。在這種診斷范式中，一個(gè)經(jīng)認可的mRNAseq協(xié)議獲取診斷樣本的全面數據。對于單次運行數據分析，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)指定的集成生物信息管道(人類(lèi)急性髓細胞白血病快速轉錄組學(xué)(HALLET)；Fig. 1)。HAMLET具有靈活的適應性和個(gè)性化，可以查詢(xún)一組選定基因的序列變異和表達水平，以及易位情況。

實(shí)驗材料

從萊頓大學(xué)醫學(xué)中心(LUMC)的血液學(xué)生物庫中選擇了100份經(jīng)機構審查委員會(huì )批準獲得的冷凍保存的急性髓系白血病樣本。所有樣本都進(jìn)行了基因分型NPM1突變和FLT3內部串聯(lián)復制(FLT3-ITD)由LUMC分子診斷實(shí)驗室認證。

實(shí)驗方法

全轉錄組測序，HAMLET輸出的驗證

結果

經(jīng)認證的mRNAseq在100個(gè)AML樣本上產(chǎn)生了4885萬(wàn)個(gè)reads(9700-17000萬(wàn)個(gè)reads)，平均插入大小為149-177個(gè)堿基。質(zhì)量控制后的平均閱讀長(cháng)度為123–124個(gè)堿基。
融合基因檢測

HAMLET在24例病例中z確檢測到中期細胞遺傳學(xué)預測的所有復發(fā)融合基因(Fig. 2a)。另外3例除t(9;11)(p21;q23)外的11q23易位病例，HAMLET正確識別了KMT2A融合相關(guān)基因MLLT1,MLLT4，和MLLT6(圖1，2)。此外，HAMLET在8例病例中正確識別了融合轉錄本，這些轉錄本不能通過(guò)中期核型分析預測，但與急性髓系白血病的預后相關(guān)(圖2b)。FUS-ERG 檢測到融合基因，其對應的t(16；21)(p11；q22)僅在其復雜核型中被鑒定。攜帶ETV6-LYN融合基因的AML(2-020)的核型為add(8)(q24)和del(12)(p13)，但缺乏特征ins(12;8)(p13;q11q21)。三個(gè)AML (2-003，2-031，2-032)發(fā)現NUP98-NSD1融合轉錄本。由于兩個(gè)參與基因的端粒位置NUP98-NSD1源于t(5；11)(q35；p15.5)，因此目前未被AML分類(lèi)，盡管其與不良預后相關(guān)。在三個(gè)病例(2-053、3-021、3-024)中發(fā)現PIM3-SCO2發(fā)生了基因融合。此前已在兒童急性髓系白血病中發(fā)現，可起源于慢性中性粒細胞白血病的0.6 Mb號染色體倒位。

HAMLET提供了融合轉錄物的詳細信息，包括差異剪接(KMT2A-MLLT3、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、CBFB-MYH11和NUP98-NSD1)和來(lái)自平衡易位的相互轉錄物，例如，RARA-PML, ERG-FUS, NUP214-DEK, 和 NSD1-NUP98?？傊?，HAMLET檢測到54種不同的融合轉錄本，這些轉錄物不能通過(guò)中期核型分析預測?？偟膩?lái)說(shuō)，28例急性髓系白血病攜帶兩個(gè)或多個(gè)融合，在一個(gè)復雜的AML中*多有9個(gè)不同的融合基因。

small variants檢測

HAMLET的VARSCAN組件在13個(gè)AML基因中鑒定出246個(gè)小變異體。HAMLET對NPM1和DNMT3A的FLT3-ITD和熱點(diǎn)區域進(jìn)行了敏感性評估，對其余的418個(gè)被HAMLET稱(chēng)為野生型的樣本進(jìn)行了靶向重測序反應。VARSCAN只識別了七個(gè)相當短的FLT3-34人中的ITDFLT3-ITD攜帶AML。在這種情況下，HAMLET都正確地識別了一個(gè)ASXL1(3-030)的30bp C末端插入和CEBPA (3-003)中一個(gè)N端易位。HAMLET檢測到的小變異體的總體類(lèi)型和分布與在COSMIC中報告的分布非常一致。

HAMLET檢測的變異在COSMIC中列出并位于定義的遺傳熱點(diǎn)內，很容易被解釋為A類(lèi)變異(n = 114;46.3%)。COSMIC中報告了60種變異(24.4%)，但沒(méi)有位于熱點(diǎn)。這些B類(lèi)變異大部分在已知突變發(fā)生在整個(gè)編碼序列中的基因中被檢測到(CEBPA,TET2，RUNX1,WT1和TP53).其余變異并未報告(C類(lèi)變異體:n= 52;21.1%)或未在COSMIC中列出但被描述為SNP(D類(lèi)變異體，n= 20;8.1%).D類(lèi)變異可能代表真正的低等位基因頻率的遺傳多態(tài)性。C類(lèi)變異體可以根據其預測的致病作用來(lái)解釋。按這種規定進(jìn)行解釋?zhuān)?0%以上的A類(lèi)變異，50%的B類(lèi)和C類(lèi)變異體和小于1%的D類(lèi)變異體是髓系惡性腫瘤的復發(fā)突變。

在TCGA AML隊列中，基因組DNA中存在的小變體已被證明在相應的RNA序列分析中是不存在的。因此，我們驗證了小變異的HAMLET結果RUNX1,TET2,TP53,DNMT3A,KIT1，和IDH1通過(guò)靶向NGS對從56例急性髓系白血病分離的基因組DNA。選擇這些病例是因為T(mén)P53，RUNX1和TET2的遺傳特征與基因突變增加的可能性有關(guān)，在這56例AML病例中，HAMLET檢測到67個(gè)變異，包括18個(gè)易位，它們是無(wú)義介導的RNA衰變的潛在靶點(diǎn)。在這67個(gè)變體中，有一個(gè)TET2三例急性髓系白血病病例中的變異體(c.4317dup)被目標NGS遺漏。這個(gè)A插入發(fā)生在6個(gè)其他A核苷酸的延伸中，顯然很難在Ion GeneStudio S5系統上進(jìn)行排序。原始數據中存在這種變異的Reads，等位基因頻率為2-3%。還有兩個(gè)變異被目標NGS發(fā)現，但被HAMLET錯過(guò)了。這些變異包括RUNX1是已被靶向NGS檢測到的錯義變異體，具有10%的低等位基因頻率和IDH1?？傊?，我們的數據顯示，HAMLETz確地調用了TET2,TP53,RUNX1,KIT,IDH1和DNMT3A包括由轉錄物編碼的所有變異，這些轉錄物是無(wú)義介導的衰變的潛在目標。我們還確定了HAMLET-RNAseq檢測所需的測序深度，并對100個(gè)急性髓系白血病進(jìn)行了20萬(wàn)、30萬(wàn)、40萬(wàn)和4750萬(wàn)個(gè)讀對的流水線(xiàn)操作。在HAMLET所稱(chēng)的246個(gè)變異中，有53個(gè)變異是無(wú)義突變或移碼突變。HAMLET檢測這些變異的z確度從100%、96%、85%下降到70%，而其余變異體的z確度從100%、98%、96%下降到81%。這些數據表明，約測5000萬(wàn)個(gè)reads的高測序深度對于確保檢測所有變異類(lèi)型是必不可少的。

等位基因的CEBPA突變?yōu)楹诵驼５腁ML帶來(lái)了良好的預后并且將一個(gè)等位基因上編碼序列的第一個(gè)357 bp內的N-末端移碼突變與c.834-1074之間的C-末端框內插入或缺失相結合，從而破壞另一個(gè)等位基因上的DNA結合。通過(guò)Illumina平臺上通?？色@得的reads長(cháng)度來(lái)證明它們在相反染色體上的位置。然而，雙等位基因CEBPA突變與特定的基因表達譜有關(guān)?；趍RNAseq的基因表達譜顯示了特征性的雙等位基因CEBPA攜帶兩個(gè)樣本的所有四個(gè)急性髓系白血病樣本的突變相關(guān)特征CEBPA突變(2-009、2-039、2-045和3-003)，包括其C端突變被HAMLET遺漏的病例3-003(圖3)。11例急性髓系白血病中，有一例CEBPA變異，一個(gè)病例(2-025)的特征性N-末端移碼突變與雙聚在一起CEBPA變異。因此，將變異檢測與基因表達譜結合分析，可以單獨解決變異檢測的不確定性。由于CEBPA 雙突變體的基因標記不是定量的，所以尚未在HAMLET中實(shí)施臨床應用。

檢測中的串聯(lián)重復FLT3和KMT2A

外顯子中常見(jiàn)串聯(lián)重復的可靠檢測FLT3在急性髓系白血病診斷中尤為重要，因為FLT3-ITD是酪氨酸激酶抑制劑治療的適應癥。除了對FLT3-ITD，其位置、大小和突變與等位基因比率對急性髓系白血病的預后有重要影響。為了改善對不充分的檢測FLT3-ITD通過(guò)VARSCAN，我們開(kāi)發(fā)了ReSCU作為一種新的算法，該算法基于在相互基因位置發(fā)生的部分對齊、SC reads的調用。

ReSCU確定了36例有FLT3-ITD，包括由VARSCAN檢測到的所有7例small ITD病例和經(jīng)認證診斷確定的所有34例病例(圖4a)。NGS的有針對性的重新排序進(jìn)一步證實(shí)了FLT3-除了兩種情況之外，所有情況下，ITD都處于軟限幅方法確定的位置(表SXIV).在兩個(gè)由ReSCU調用但不是由標準診斷調用的不一致案例中，SC reads占其各自位置總覆蓋率的小于1%。仔細審查原始數據顯示FLT3-在這兩種情況下，ITD信號都低于檢測閾值，表明HAMLET的靈敏度更高(圖S6).突變型與正常型的等位基因比FLT3片段與ReSCU調用的SC reads百分比有很好的相關(guān)性(圖4b).

KMT2A-PTD外顯子2–13，這對于將AML 分類(lèi)到染色質(zhì)剪接組，導致蛋白質(zhì)延長(cháng)，對AML的臨床結果產(chǎn)生不利影響。ReSCU識別的KMT2A-PTD外顯子2-8和2-10分別出現在4和2病例中，外顯子2、2-3和3-6的重復出現在單個(gè)病例中(圖4c)。全部九個(gè)KMT2A-PTD通過(guò) RT-PCR和測序進(jìn)行驗證。

基因過(guò)表達的檢測

結構正?；虻倪^(guò)度表達會(huì )影響急性髓系白血病患者的預后BAALC, ERG, MN1, DNMT3B, SPARC, and EVI1。mRNAseq測量過(guò)表達的可靠性被評估為預示AML預后非常差的EVI1轉錄本(圖5a)。過(guò)表達EVI1可由inv(3)(q21q26)或t(3;3)(q21;q26)，但是存在替代的分子機制。mRNAseq檢測到的EVIl外顯子1的表達與定量RT-PCR檢測結果有很好的相關(guān)性(圖5b).兩例(1- 005,3 -029)攜帶inv(3)(q21q26)和1例(1-008)攜帶t(3;8)(q26;q24)均可見(jiàn)高EVI1表達。在另外4例EVI1高表達的病例中，1例有der(3)t(1;3)(q3?1;q2?5)，沒(méi)有可識別的MECOM1位點(diǎn)參與(病例3-022)。這3例EVIl過(guò)表達而無(wú)3q26異常的病例均攜帶KMT2A融合轉錄本(case 1-001和3-008:KMT2A-MLLT3；case2-047:KMT2A-MLLT4)。這種遺傳變異的組合表明AML的預后極差。

Fig. 5 Detection of EVI1 overexpression. a Schematic representation of two mRNA transcripts from the MECOM locus on chromosome 3. One transcript contains exon 1–2 of MDS1 fused to exon 2–15 of EVI1 (MDS1-EVI1 transcript), whereas the other transcript contains exon 1–15 of EVI1 (EVI1 transcript). b Comparison of EVI1 expression by RNAseq and quantitative RT-PCR. Xaxis: Expression of the first exon of EVI1 normalized for expression of the PBGD housekeeping gene by quantitative RT-PCR (log2 EVI1/PBGD). Y-axis: Sum of base coverage of the first exon of EVI1 per kb transcript and one million mapped reads (log2 BPKM) by RNAseq

克隆進(jìn)化

HAMLET揭示了克隆進(jìn)化，在診斷和復發(fā)時(shí)采集的所有四對樣本中獲得和丟失了遺傳變異。盡管基因型明顯不同，但IDH2突變作為起始事件的持續存在確立了新生AML和后續治療相關(guān)AML的共同起源(case 3-021、3-038)。因此，一個(gè)獨立的、與治療相關(guān)的AML的診斷被糾正為原始AML的復發(fā)，盡管兩個(gè)樣本將被分類(lèi)為不同的AML亞型。

急性髓系白血病的分類(lèi)和預測

根據HAMLET和中期核型分析結果，99例病例可根據世衛組織2016年和基因組分類(lèi)進(jìn)行重新分類(lèi)(圖6)。HAMLET信息促進(jìn)了6個(gè)案例的風(fēng)險重新評估，值得注意的是通過(guò)NUP98-NSD1融合而無(wú)分類(lèi)明確病變的AML，或通過(guò)EVIl過(guò)表達而無(wú)inv(3)(q21q26)來(lái)分配風(fēng)險。

 

原文鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32127641

百邁客轉錄組優(yōu)勢：

超高性?xún)r(jià)比：一次測序，4組數據，多篇文章

樣本全：組織、細胞、粘膜、毛囊均可建庫測序

經(jīng)驗豐富：常規建庫起始量低；低起始量的珍惜樣本也可建庫成功

強大生信分析：可提供基本分析和高階分析，滿(mǎn)足個(gè)性化調整

全套服務(wù)：組織樣本取樣、建庫、測序、數據分析全套服務(wù)

云分析平臺：百邁客云平臺已經(jīng)研發(fā)快速高效的云平臺，可高效呈現高質(zhì)量文章圖表和對大數據進(jìn)行挖掘；

百邁客的測序服務(wù)結合強大的云分析平臺，可以根據您的研究目的提供個(gè)性化分析，針對性地挖掘出豐富多彩的結果圖譜。