研究背景
肝臟由超過(guò)20種細胞類(lèi)型組成，包括肝細胞、肝內皮細胞、膽管細胞、間皮細胞、ER細胞和各種循環(huán)免疫細胞。在人類(lèi)胎兒的發(fā)育過(guò)程中，肝臟是重要的造血器官。造血干細胞和祖細胞（HSPC）在大約6周時(shí)在人體內遷移到肝芽中。然后，胎兒肝臟成為主要的造血器官，并為HSPC增殖和分化提供了特定的生態(tài)位。肝臟是人體的重要器官之一，易受體內外多種致病因素的影響，引起炎癥和損傷。肝臟疾病是導致發(fā)病率和死亡率的主要因素。此外，肝臟有很強的再生能力。肝部分切除術(shù)后，肝臟的再生依賴(lài)于殘余肝組織的再生能力。因此，對胎兒肝臟發(fā)育的研究對于我們了解肝臟發(fā)育和再生機制也至關(guān)重要。
結論
本文中作者結合了單細胞RNA測序和空間轉錄組學(xué)（ST）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，對人類(lèi)從受孕后8周（PCW）到17周（PCW）的胎兒肝臟進(jìn)行了分析。系統地鑒定了9種細胞類(lèi)型，并確定了主要細胞類(lèi)型的發(fā)育途徑。結果表明，人胎肝在實(shí)驗期間經(jīng)歷了血液的快速生長(cháng)和遷移，并鑒定了紅系細胞發(fā)育過(guò)程中的差異表達基因和代謝變化。此外，作者還對肝病相關(guān)基因的表達進(jìn)行了研究，發(fā)現17個(gè)已發(fā)表并與肝病相關(guān)的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞類(lèi)型中幾乎不表達?？傊?，作者的研究結果提供了一個(gè)全面而清晰的了解人類(lèi)胚胎肝臟中所有主要細胞類(lèi)型的分化過(guò)程，這可能為肝臟疾病的治療和肝臟再生提供參考數據和信息。
中文題目：整合空間轉錄組學(xué)和單細胞轉錄組揭示了人類(lèi)胚胎肝臟的基因表達譜
英文題目：Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver.
期刊：Front Cell Dev Biol
發(fā)表時(shí)間：2021.5
作者：Xianliang Hou
材料與方法
材料：受孕后8周和17周人類(lèi)發(fā)育中的肝組織；
方法：10× Genomics Visium Spatial Gene Expression Slides。
實(shí)驗結果
一、細胞聚類(lèi)與類(lèi)型鑒定
為了研究胎兒肝臟中免疫細胞和紅細胞的發(fā)育，作者利用ST技術(shù)分析了人類(lèi)肝臟發(fā)育過(guò)程中基因表達的時(shí)空動(dòng)態(tài)。在篩選數據后，在8周PCW肝臟中檢測到1267個(gè)高質(zhì)量spots，平均每個(gè)spot包含204,628條reads，檢測到1,132個(gè)基因和5,924個(gè)UMIs。在17周PCW中，肝臟由3,489個(gè)單獨spots組成，平均78,576條reads，8,829個(gè)UMI，過(guò)濾后每個(gè)點(diǎn)檢測到2,266個(gè)基因。通過(guò)對每個(gè)ST陣列的spots進(jìn)行降維和聚類(lèi)，根據基因表達模式在8周PCW肝臟（圖1A）和17周PCW肝臟（圖1B）中確定了6個(gè)和10個(gè)主要cluster。由于ST缺乏細胞分辨率，作者利用scRNA-seq技術(shù)研究了8周PCW和17周PCW活組織的基因表達異質(zhì)性。在應用質(zhì)量控制過(guò)濾器和標準化后，scRNA序列數據分別25,186個(gè)細胞和9,153個(gè)細胞組成，每個(gè)細胞中有2,454和2,705個(gè)獨特表達的基因。為了探索活體器官的細胞組成，作者處理了單細胞數據，并在8和17周PCW肝臟中鑒定了31和25種細胞狀態(tài)，每種狀態(tài)都根據文獻中已知的標記基因進(jìn)行了注釋?zhuān)▓D1C-F）。作者將這些cluster鑒定為B細胞、樹(shù)突狀細胞（DC）、DC1、DC2、早期成紅細胞、內皮細胞、HSC_MPP、成纖維細胞、肝細胞、kuper、ILC、晚期成紅細胞、MEMP、肥大細胞、巨核細胞、中成紅細胞、單核細胞、中性粒細胞、NK、pDC、Pre、Pre-B、Pro-B和VCAM1+。
圖1
二、Multimodal交互式分析
為了整合scRNA-seq和ST數據集，作者應用了先前報道的Multimodal Intersection Analysis(MIA)進(jìn)行分析。通過(guò)MIA方法發(fā)現在跨空間區域識別細胞類(lèi)型的消耗和富集方面是穩健的（圖2A，B）。例如，作者發(fā)現肝細胞、kuper細胞、內皮細胞和巨核細胞的高表達基因在ST和scRNA序列數據之間顯著(zhù)重疊（圖2C）。8周 PCW肝臟由kuper、中成紅細胞、肝細胞、晚期成紅細胞、早期成紅細胞組成（圖2D）。17 周PCW肝臟由肝細胞、中性粒細胞、早期成紅細胞、中期成紅細胞、晚期成紅細胞、巨核細胞、內皮細胞和巨核細胞組成（圖2E）?；谄骄鶎底兓?，每個(gè)cluster的前10個(gè)基因的熱圖顯示了cluster之間的高度異質(zhì)性（圖3A，B）。此外，作者在每種細胞類(lèi)型中選擇一個(gè)最明顯的特征基因，并以點(diǎn)圖的形式呈現以比較差異（圖3C）。根據轉錄相似性，用單核細胞按預測的發(fā)育軌跡（擬時(shí)序）組織細胞。它產(chǎn)生了一個(gè)緊密相連的分化軌跡，分為兩個(gè)主要分支，分別對應于不同時(shí)期的8和17 PCW（圖3D）
圖2
圖3
三、人胎肝細胞的空間分辨異質(zhì)性
如圖3E所示，肝細胞是17 PCW肝臟的主要實(shí)質(zhì)細胞。作者觀(guān)察到三個(gè)不同的肝細胞cluster（cluster1、3和4）沿著(zhù)17周PCW肝臟的空間深度分布（圖4A、B）。作者發(fā)現MEG3、ITIH3和HMGCS1呈cluster1高表達。FGB、IGFBP1和A2M基因在cluster3中表達更高，表明區域DEGs可能參與了相應區域特異性功能的形成。此外，cluster4組中的肝細胞高表達數個(gè)基因，包括MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3，它們參與線(xiàn)粒體電子傳遞和氧化磷酸化。值得注意的是，cluster1和3主要聚集在肝組織的中心區域，cluster4主要聚集在肝的周?chē)鷧^域（圖4a）。差異表達分析的熱圖顯示肝細胞分化過(guò)程中逐漸下調或上調的基因。GO分析表明，1-3-4cluster中逐漸上調的基因主要與細胞極性通路、Wnt信號通路和GTPase活性的調節有關(guān)，而逐漸下調的基因則參與壞死細胞死亡、糖原生物合成過(guò)程的調節，肝臟再生。此外，作者描述了cluster1-3-4細胞之間的細胞通訊（圖4C），為將來(lái)的研究提供了潛在的信號轉導信息。值得注意的是，盡管cluster3和cluster1的距離更近，但cluster3與cluster4細胞的信號轉導比cluster1細胞更為顯著(zhù)。此外，作者還發(fā)現了一些共享的和活躍的配體-受體對，如DLK1-NOTCH2、EFNA1EPHA2、AGT-AGTR1，這些配體-受體對既存在于cluster1細胞與cluster4細胞的細胞通訊中，也存在于cluster3細胞與cluster4細胞的細胞通訊中。
在17周PCW肝臟的scRNA序列數據中，肝細胞可進(jìn)一步細分為三個(gè)cluster。熱圖顯示了每個(gè)cluster的前十個(gè)標記基因（圖4D）。作者檢測了LGR5的表達模式，并根據scRNA-seq數據發(fā)現了一部分LGR5+肝母細胞（圖4E）。在8 周PCW肝臟，5.68%的肝母細胞表達LGR5，而在17周 PCW肝臟，LGR5+細胞的比例下降到3.80%。此外，在8和17 PCW肝臟存在HNF4A+ID3+肝母細胞亞群（圖4F）。作者將這些HNF4A+ID3+細胞命名為ID3+肝母細胞。scRNA-seq數據顯示，8周PCW肝母細胞中25.26%（475個(gè)細胞中120個(gè)細胞）和17周PCW肝母細胞中15.76%（184個(gè)細胞中29個(gè)細胞）屬于這個(gè)cluster。此外，DLK1在ID3+肝母細胞中高表達，而NCAM1在ID3+肝母細胞中不表達。作者在17 PCW胎肝中鑒定出巨核細胞的兩種主要細胞狀態(tài)（cluster7和cluster10）（圖2E）。結果顯示，第7組中PF4、PPBP、ITGA2B、GP9和MYL9上調，第10組中JCHAIN、IGLC3、IGLC2、IGHM和IGKC上調。
圖4
四、人胎肝組織紅細胞分化與成熟途徑研究
在8PCW肝臟中，小的紅細胞簇散布在整個(gè)肝臟中（圖5A）。在17PCW肝臟中，肝臟充滿(mǎn)了紅細胞，并且完全變紅（圖5b）。值得注意的是，早期的紅細胞位于肝組織的外圍，而中期紅細胞和晚期紅細胞則分散在肝組織的中心區域（圖5B）。這一戲劇性的形態(tài)學(xué)變化表明，在實(shí)驗研究期間，人類(lèi)胎兒肝臟都經(jīng)歷了血液的快速生長(cháng)和遷移。在8和17PCW肝中均有早、中、晚期成紅細胞。為了研究紅細胞的發(fā)育過(guò)程，作者研究了這三種類(lèi)型紅細胞間差異表達的基因。在8PCW肝臟中，818個(gè)基因在早、晚分化過(guò)程中逐漸下調，2648個(gè)基因在早、晚分化過(guò)程中逐漸上調。逐漸上調的基因富含乙醛酸和二羧酸代謝、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝和嘌呤代謝，而逐漸下調的基因與丁酸代謝相關(guān)（圖5C）。在17PCW肝組織中，有812個(gè)基因在分化早期、中晚期逐漸下調，880個(gè)基因在分化早期、中晚期逐漸上調。
對下調基因的KEGG富集分析顯示，最顯著(zhù)的包括果糖和甘露糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、?；撬岷偷团；撬岽x、組氨酸和硫胺代謝相關(guān)的信號通路。上調基因的高度富集項與丙酸代謝有關(guān)（圖5D）。作者進(jìn)行了早、中、晚期細胞間的配體-受體相互作用分析，發(fā)現在早期-中晚期細胞通訊中發(fā)現了促紅細胞生成素（EPO）、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C（PTPRC）、連接蛋白細胞粘附分子3（NECTIN3）（圖5E）。此外，還對紅細胞的分化軌跡進(jìn)行了分析，得出了一條緊密相連的分化軌跡，分化成五個(gè)主要分支（圖5F）。這表明系統是通過(guò)一個(gè)連續的而不是幾個(gè)斷開(kāi)的譜系來(lái)維持的。此外，在8PCW肝臟和17PCW肝臟的早期、中期和晚期紅細胞中分別鑒定了617、674和503個(gè)DEGs。為了進(jìn)一步了解8PCW肝臟和17PCW肝臟之間紅細胞的差異，對兩個(gè)胚胎階段的基因表達模式進(jìn)行了PCA分析。從每種細胞類(lèi)型中取樣50個(gè)點(diǎn)以產(chǎn)生平衡的數據集，并且發(fā)現基于它們的轉錄相似性可以區分8 PCW和17 PCW肝臟中的所有點(diǎn)（圖5G，H）。
圖5
五、人胎肝組織中肝病相關(guān)基因的表達模式
為了確定與肝臟疾病胎兒起源相關(guān)的功能基因，作者將胎兒肝臟ST數據與公開(kāi)的網(wǎng)絡(luò )資源整合，以直觀(guān)地探索與肝臟疾病相關(guān)的細胞類(lèi)型和空間區域。17個(gè)已發(fā)表并與肝病相關(guān)的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在任何其他細胞類(lèi)型中幾乎不表達（圖6A，B）。例如，SPP1、TGFB1、JAG1、STAT1和VIM與先天性膽道閉鎖有關(guān)，并被證實(shí)在內皮細胞和巨核細胞中強烈表達。TGFB1和THBS1（先天性肝纖維化相關(guān)）在巨核細胞和內皮細胞中也有高表達。此外，兒童肝細胞癌相關(guān)基因SPP1和TGFB1在內皮細胞和巨核細胞中也有強表達。值得注意的是，SPP1和TGFB1基因不僅與先天性（和兒童期）肝病有關(guān)，也與成人肝病有關(guān)。在此，作者還分析了一些與成人肝病相關(guān)的基因的特異性表達。例如，乙型肝炎相關(guān)基因（GP1BA、HSPG2、CCL5和SPP1）、脂肪肝相關(guān)基因（COL3A1、CCL5和SPP1）、酒精性肝病相關(guān)基因（CAV1、ELANE、CCL5和SPP1）、原發(fā)性膽汁性肝硬化相關(guān)基因（TGFB1、PDE5A、COL1A1、CCL5和SPP1）和原發(fā)性惡性肝腫瘤相關(guān)基因（SELP、PECAM1、，HSPG2和THY1）主要表達于內皮細胞和巨核細胞，在其他細胞中幾乎不表達。
為了進(jìn)一步揭示這一現象，作者分析了這17種肝病相關(guān)基因在17PCW胚胎腎臟中的表達水平。除PECAM1外，其余基因在17PCW腎中表達。但其表達模式與肝臟不同，主要不在巨核細胞和內皮細胞中表達，說(shuō)明這些肝病相關(guān)基因在胚胎肝臟中具有獨特的基因表達模式。此外，對這17個(gè)肝病相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò )分析顯示TGFB1、COL1A1、SPP1、PECAM1和THBS1在表達網(wǎng)絡(luò )中起關(guān)鍵作用，而PDE5A與其他基因沒(méi)有相互作用（圖6C）。
圖6
六、人胎肝組織發(fā)育基因分析WGCNA分析
為了更好地了解與肝臟發(fā)育相關(guān)的基因調控變化和細胞類(lèi)型之間的相互作用，作者使用WGCNA算法構建了一個(gè)基于主要細胞簇中差異表達基因的ST數據無(wú)偏共表達分析。在8PCW肝臟中確定了5個(gè)主要的共表達模塊，并在17PCW肝臟中定義了兩個(gè)基因表達模塊（相關(guān)指數>0.56）（圖7A）。每個(gè)模塊在細胞cluster中顯示出不同的相關(guān)性。分析這些模塊發(fā)現，許多模塊是由基因優(yōu)先表達在特定的細胞群。此外，高相關(guān)性模塊往往包含豐富的KEGG途徑、GO生物過(guò)程和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò )，這進(jìn)一步突出了基因功能的協(xié)作模式（圖7B）。在8 PCW肝臟中，KEGG分析顯示藍色模塊富集了多種途徑，包括核糖體、DNA復制和谷胱甘肽代謝。黃色模塊23個(gè)基因的共表達網(wǎng)絡(luò )顯示了PF4和PPBP在表達網(wǎng)絡(luò )中的重要作用。此外，細胞群之間的細胞通訊和信號轉導調控是胎兒肝臟發(fā)育的過(guò)程。為了研究胎兒肝臟中的細胞通訊和空間串擾，作者進(jìn)行了配體-受體相互作用分析，發(fā)現細胞cluster之間存在活躍的細胞通訊（圖7C、D）。CD74-MIF、DLK1-NOTCH3、IGF2-IGF1R、AGT-AGTR1和CCL2-ACKR1等配體-受體對在8PCW肝臟中更常見(jiàn)，ESAM-ESAM、TIMP1-FGFR2、JAG1-NOTCH3、LTBR-LTB和PLXNB2-PTN等配體-受體對在17PCW肝臟中更常見(jiàn)。此外，8PCW和17PCW肝臟共有129個(gè)配體-受體對。
圖7
討論
人類(lèi)胎兒肝臟在子宮內的發(fā)育至今仍知之甚少。在這項研究中，作者應用了一種方法來(lái)識別和空間定位胎兒肝組織中不同的細胞狀態(tài)、亞群和細胞類(lèi)型。該方法首先通過(guò)scRNA-seq對活組織中存在的cluster和細胞類(lèi)型進(jìn)行表征，同時(shí)通過(guò)ST鑒定轉錄組區域。通過(guò)MIA，可以完美地整合ST數據和scRNA-seq數據，并以無(wú)偏的方式分析感興趣區域的數據。
在ST和scRNA-seq數據中鑒定了三個(gè)肝細胞亞群，它們在每個(gè)亞群中顯示出不同的基因表達和功能富集。提示不同區域的肝細胞可能具有不同的功能。在這些亞群的細胞通訊中，發(fā)現了幾種活性配體-受體對，如DLK1NOTCH2、EFNA1-EPHA2、AGT-AGTR1。
自從Barker（1990）發(fā)表了《成人疾病的胎兒和嬰兒起源》以來(lái)，人們對宮內環(huán)境及其對成人疾病的影響給予了極大的重視。環(huán)境的變化會(huì )引起身體的反應和調整。在胚胎階段，所有組織器官都處于發(fā)生、分化和發(fā)育的最敏感階段。如果宮內環(huán)境不利于胚胎分化和發(fā)育，那么胚胎會(huì )發(fā)生結構和功能變化，包括表觀(guān)遺傳機制，這種胚胎的適應性變化將對其生命造成嚴重甚至不可逆轉的損害。在本研究中，作者重點(diǎn)研究了肝臟疾病相關(guān)基因在胚胎肝臟中的表達，發(fā)現17個(gè)已發(fā)表并與肝臟疾病相關(guān)的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞中幾乎不表達。
綜上所述，將scRNA-seq數據與空間信息相結合，識別出一套全面的基因探針，這些探針可以總結空間和細胞信息，并提供對人類(lèi)胎兒肝臟中所有細胞類(lèi)型分化過(guò)程的清晰而全面的了解。本研究所得的結果有助于今后的研究免疫性和感染性肝病發(fā)病機制的研究及治療靶點(diǎn)的確定。
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