微生物多組學(xué)研究分析已經(jīng)在眾多疾病中發(fā)揮著(zhù)越來(lái)越重要的作用，百邁客目前不僅提供二代微生物檢測，還提供三代微生物檢測，并且已經(jīng)成功將微生物與其他組學(xué)聯(lián)合分析。
今天想跟大家談一談腸道微生物研究中的多組學(xué)分析思路。我們來(lái)看看百邁客成功案例是如何將通過(guò)代謝組學(xué)和微生物多樣性多組學(xué)揭示中醫藥葛根素在非酒精性脂肪性肝(NASH）的應用。
廣州中醫藥大學(xué)藥學(xué)院、 廣東藥科大學(xué)中醫學(xué)院、中山大學(xué)附屬第六醫院聯(lián)合在Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis雜志發(fā)表以“Therapeutic potential of puerarin against methionine-choline-defificient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis determined by combination of 1H NMR spectroscopy-based metabonomics and 16S rRNA gene sequencing”為題的文章，揭示葛根素對非酒精性脂肪性肝炎的治療方向的相關(guān)研發(fā)現，從而為非酒精性脂肪性肝病的治療提出新的見(jiàn)解理論基礎。其中微生物多樣性檢測由百邁客協(xié)助完成。
中文題目：代謝組學(xué)和微生物多樣性聯(lián)合測定葛根素對蛋氨酸膽堿缺乏膳食誘導的非酒精性脂肪性肝炎的治療潛力
期刊雜志：Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
影響因子：IF=4.0
發(fā)表時(shí)間：2021年4月15日
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33601157/
研究背景
先前發(fā)表的研究揭示了葛根素對非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的保護作用，但該作用的確切機制仍不清楚?，F在的工作是嘗試通過(guò)使用代謝組學(xué)和16S rRNA基因測序技術(shù)（微生物多樣性檢測）的組合來(lái)評估葛根素對 C57BL/6 小鼠蛋氨酸膽堿缺乏 (MCD) 飲食誘導的 NASH 的有益作用和潛在機制?；诤舜殴舱?(NMR) 的代謝組學(xué)在 MCD 飲食喂養的小鼠和健康對照。在小鼠肝臟組織和尿液中，總共有 8 種和 13 種代謝物被鑒定為與 NASH 相關(guān)的差異代謝物。富集的途徑主要是包括嘧啶代謝、一碳代謝、氨基酸代謝、糖酵解、三羧酸（TCA）循環(huán)和酮體的合成和降解。此外，微生物多樣性測序分析描繪了響應 MCD 飲食的腸道微生物群譜的顯著(zhù)變化，在小鼠中發(fā)現了 40 種與 NASH 相關(guān)的差異細菌分類(lèi)群團體。葛根素可部分改善NASH小鼠的肝脂肪變性和炎癥代謝紊亂和重新平衡腸道菌群。具體來(lái)說(shuō)，葛根素可以抑制脂多糖(LPS) 產(chǎn)螺桿菌屬，并促進(jìn)產(chǎn)丁酸鹽的 Roseburia 屬。這些發(fā)現為深入了解 NASH 的發(fā)病機制提供了新的見(jiàn)解，并提供了進(jìn)一步的葛根素作為抗 NASH 藥物的潛在用途的證據。
實(shí)驗材料與方法
材料：
八周齡雄性 C57BL/6 小鼠，馴化 1 周后，將動(dòng)物隨機分為三組（n = 6每組）：
對照組喂食甲硫氨酸 – 膽堿充足（MCS）飲食（Dyets，Inc.，Bethlehem，Pennsylvania）4周；
模型組喂食MCD飲食（Dyets, Inc., Bethélehem, Pennsylvania）4周；
葛根素組喂食MCD 飲食并與葛根素同時(shí)灌胃給藥（0.2 g/kg，懸浮在 0.5% 羧甲基纖維素鈉中）每天一次，持續 4 周，
取小鼠的尿液、糞便、肝組織作為檢測樣本；
方法：
代謝組分析，微生物多樣性檢測，血清和肝組織生化測定
研究結果
1. 葛根素治療可改善MCD飼料喂養小鼠的肝脂肪變性和炎癥
如圖1A-C所示，4周MCD喂養小鼠后，小鼠體重和肝臟體重顯著(zhù)下降。葛根素治療可顯著(zhù)減輕體重損失，但對肝臟重量沒(méi)有影響。但3個(gè)試驗組的肝/體質(zhì)量比無(wú)顯著(zhù)差異。ALT和AST通常用于評估肝細胞損傷。與對照組相比，NASH模型組血清ALT、AST活性顯著(zhù)升高，TG、TC明顯降低。葛根素補充消除了血清中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的升高，但對血清中TC和TG沒(méi)有影響(圖1D G)。在MCD飲食誘導的NASH小鼠中，觀(guān)察到肝臟TG含量顯著(zhù)升高，而葛根素治療則阻止了這種積累。肝TC含量各組間無(wú)差異(圖1H I)。MCD飼料喂養的模型小鼠與正常小鼠相比，肝切片的H&E和 Oil Red O染色顯示，肝切片出現微泡和大泡性脂肪變性，并伴有炎癥細胞浸潤和肝細胞球化。
圖1. 葛根素治療或不治療MCD日糧喂養C57BL/6小鼠4周的特征
葛根素處理的小鼠表現出肝細胞中的脂肪沉積、炎癥和氣球樣變明顯減少（圖 2）。本文的結果表明葛根素可以對小鼠 MCD 飲食誘導的 NASH 的有益影響。
圖2. 葛根素改善MCD飲食誘導的NASH小鼠肝臟組織學(xué)
2. 葛根素治療可減輕MCD飲食喂養小鼠的代謝紊亂
圖3A和圖4a顯示了小鼠肝臟組織和尿液的代表性1H NMR譜圖。為了研究NASH對小鼠代謝紊亂的影響，基于小鼠肝組織和尿液樣本的歸一化核磁共振波譜數據，計算PCA和OPLS-DA模型，揭示葛根素的干預作用。觀(guān)察到對照組和模型組之間肝臟和尿代謝表型的清晰分離(圖3B, 4b和S1)，表明MCD飲食誘導小鼠NASH后發(fā)生了一些顯著(zhù)的生化變化。此外，PCA 和 OPLS-DA 得分圖揭示肝臟和泌尿代謝的完全分化模型和葛根素組之間的概況以及顯示葛根素組有恢復到健康對照組的趨勢，這可能歸因于葛根素對NASH的治療效果。兩個(gè)模型參數R2Y 和 Q2 以及置換測試的結果說(shuō)明了OPLS-DA 模型的有效性（圖 3C 和 4C）。
圖3? 肝臟代謝組學(xué)分析
圖4. 尿液代謝組學(xué)分析
基于來(lái)自 OPLS-DA 模型的 VIP 值（VIP ≥ 1）和來(lái)自單變量統計分析的 P 值 (P < 0.05)，8 和 13顯著(zhù)改變與 NASH 相關(guān)的內源性代謝物是分別被鑒定為肝組織和尿液中的潛在生物標志物（圖 5A 和 B，以及表 1）。肝臟代謝特征NASH 模型小鼠的 ｗ-6 脂肪酸水平升高，谷氨酰胺、丙酮酸、琥珀酸、谷胱甘肽/GSSG、尿苷和尿嘧啶，連同的磷脂酰乙醇胺水平降低。關(guān)于健康控制與對照組相比，模型組尿中n -乙酰糖蛋白(NAG)、丙酮酸、2-氧戊二酸、肌氨酸、苯乙酰甘氨酸、乳酸水平升高，丙氨酸、賴(lài)氨酸、丙酮、乙酰乙酸、?；撬?、甜菜堿、肌酐水平降低。此外，除了肝臟組織中的谷氨酰胺、丙酮酸和磷脂酰乙醇胺(PE)以及尿液中的丙氨酸和苯乙酰甘氨酸外，所有與NASH相關(guān)的潛在生物標志物均被葛根素顯著(zhù)逆轉。
代謝途徑分析與MetaboAnalyst來(lái)探索MCD飲食誘導小鼠NASH最相關(guān)的途徑。根據大于0.1的影響值，發(fā)現被干擾的代謝途徑(圖5C和6)主要包括酮體的合成和降解、?；撬岷痛闻；撬岽x、丙酮酸代謝、谷胱甘肽代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丁酸代謝和糖酵解/糖異生。這些途徑表明它們具有作為葛根素抗NASH的靶向途徑的潛力。
圖5. 與NASH相關(guān)的差異代謝物功能富集分析
3. 葛根素處理可調節M(mǎn)CD飼糧小鼠腸道菌群組成
文中通過(guò)對18個(gè)MCD 飲食喂養的小鼠腸道內容物進(jìn)行微生物多樣性測序（16s rDNA V3+V4），總共產(chǎn)生了 1,358,128 個(gè)原始序列，質(zhì)控過(guò)濾后總共鑒定 856,180 個(gè)序列（每個(gè)樣本的讀數為 47,565 ± 7749）。然后將相似度為 97%的高質(zhì)量序列劃分為333 個(gè) OTU。稀有與香農指標分析表明，測序深度罕見(jiàn)的覆蓋了新類(lèi)型和大部分微生物多樣性（圖 7A）。根據ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數，三組間alpha多樣性無(wú)顯著(zhù)差異。然而，未加權的 UniFrac PCoA 顯示小鼠的整體腸道菌群微生物群組成結構發(fā)生了明顯變化，給予葛根素重塑了NASH小鼠的菌群組成。
圖6. 小鼠糞便微生物組16S rRNA基因測序分析
門(mén)水平的分類(lèi)分析表明，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)在所有類(lèi)群的糞便微生物群落中占優(yōu)勢。與對照組相比，模型組的Epsilonbacteraeota水平較高，而葛根素處理可逆轉這一趨勢(圖7D)。采用LEfSe方法，篩選出LDA評分大于2.0的明顯改變的類(lèi)群，以鑒定類(lèi)群間(門(mén)到屬)的差異類(lèi)群。如圖8和圖9所示，在對照組和模型組之間，模型和葛根素組之間，共發(fā)現了40和24個(gè)不同的細菌分類(lèi)分支。有趣的是，在葛根素治療后，14種不同的細菌類(lèi)群在NASH小鼠中顯示出相同的恢復正常水平的趨勢,包括p Epsilonbacteraeota, c Campylobacteria、o彎曲菌目、 f 螺桿菌科、 g幽門(mén)螺桿菌屬、p 脫鐵桿菌門(mén)、c 脫鐵桿菌、 o 脫鐵桿菌、 f 脫鐵桿菌科、g Mucispirillum、o Betaproteobacteriales、f burkholderaceae、g Parasutterella 和g瘤胃球菌科NK4A214組。值得一提的是，模型小鼠中氏菌屬的成員比對照組小鼠大，葛根素治療后進(jìn)一步擴大。（字母 p、c、o、f 和 g 分別代表門(mén)、綱、目、科和屬）
圖7. 計算配對組間差異分類(lèi)支系的LEfSe LDA評分直方圖
圖8. 分類(lèi)樹(shù)配對組間細菌分類(lèi)差異的LEfSe分支圖
4.MCD喂養小鼠腸道菌群與代謝表型的相關(guān)性
為了探索腸道微生物組和代謝組之間可能的功能關(guān)系，作者在屬水平上對差異細菌類(lèi)群和與NASH相關(guān)的差異肝臟和尿液代謝物進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析(圖10)。作為脂多糖(LPS)的產(chǎn)生菌，幽門(mén)螺桿菌屬在模型組中富集，與模型組混合尿糖蛋白中復合n -乙?；盘柕脑黾映蕪娬嚓P(guān)，這與急性期炎癥反應有關(guān)。
圖9. 小鼠腸道菌群在屬水平上的紊亂以及肝臟和尿液代謝產(chǎn)物的改變之間的相關(guān)性
文章總結
以NMR為基礎的代謝組學(xué)和微生物多樣性多組學(xué)相結合，評價(jià)葛根素在MCD飼養小鼠中的抗NASH活性。研究結果表明，葛根素可以通過(guò)改善與NASH相關(guān)的代謝紊亂和重新平衡腸道菌群來(lái)改善小鼠的肝脂肪變性和炎癥。這些結果為葛根素對MCD飲食誘導的NASH的肝保護作用提供了重要的機制見(jiàn)解。
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參考文獻：
Gong MJ, Zhu CY, Zou ZJ, et al. Therapeutic potential of puerarin against methionine-choline-deficient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis determined by combination of 1H NMR spectroscopy-based metabonomics and 16S rRNA gene sequencing. J Pharm Biomed Anal. 2021 Apr 15;197:113964. doi: 10.1016/j.jpba.2021.113964.
文獻下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33601157
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