Hi-C多組學(xué):構建人類(lèi)胚胎發(fā)育中染色質(zhì)的結構-解析CTCF的重要作用 |

發(fā)布于 2021年10月9日

文獻名稱(chēng)：Key role for CTCF in establishing chromatin structure in human embryos

期刊：Nature

導讀

在細胞周期的中間階段，染色質(zhì)以分級結構排列在核中，這在調節基因表達方面具有重要作用。但是，人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中3D染色質(zhì)結構的動(dòng)力學(xué)仍然未知。在這里作者報告，與小鼠精子不同，人類(lèi)精子細胞不表達染色質(zhì)調節劑CTCF，其染色質(zhì)不包含拓撲關(guān)聯(lián)域（TADs）。人類(lèi)受精后，TAD結構在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸建立。此外，A / B區室化在人類(lèi)胚胎2細胞階段中消失，并在后續胚胎發(fā)育過(guò)程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類(lèi)胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達，然后在觀(guān)察到TAD時(shí)在ZGA階段高表達。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結構顯著(zhù)減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類(lèi)胚胎中的TAD建立需要CTCF表達。結果表明，CTCF在人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中的3D染色質(zhì)結構建立中具有關(guān)鍵作用。

實(shí)驗方法

材料：小鼠精子和桑椹胚

方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2

研究?jì)热?/h4>
1、人類(lèi)早期胚胎的TAD結構

作者檢測了人類(lèi)精子和胚胎中的染色質(zhì)相互作用。但是沒(méi)有檢測到人類(lèi)2細胞胚胎中TAD結構的特征性“三角”相互作用。在8細胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對分析的影響，在繪制每個(gè)階段的相互作用熱圖時(shí)，作者隨機選擇了相同數量的read。作者進(jìn)一步調查了人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中的TAD重編程。使用TAD分離分數方法（Methods）來(lái)獲得TAD結構和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測到大多數TAD域。作者還計算了TAD信號和方向指數。本文的數據表明，TAD信號方差和方向指數在2細胞階段最低，并隨著(zhù)發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實(shí)驗偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對照，將其與人2細胞，8細胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構建了Hi-C庫。同時(shí)，還為未與人類(lèi)樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫。這些結果表明，混合樣品中的TAD結構在人類(lèi)2細胞胚胎中仍然模糊不清，在8細胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見(jiàn)TAD結構。來(lái)自混合樣品的TAD信號分析支持了作者的發(fā)現，即TAD結構在人類(lèi)胚胎發(fā)生過(guò)程中得以確立。
總之，這些數據表明，TAD結構在人的2細胞胚胎中基本上不存在，在8細胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過(guò)程中變得越來(lái)越明顯。

圖a 人類(lèi)精子，人類(lèi)胚胎和H1人類(lèi)ES細胞（hESCs）中高階染色質(zhì)結構相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學(xué)重復；n = 2-3）。

圖b 用相等數量的reads（每個(gè)階段從2-3個(gè)生物學(xué)復制中產(chǎn)生）計算出的人類(lèi)胚胎中TAD信號的相對方差。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗。數據為平均值±s.e.m。

圖c 人類(lèi)胚胎中500kb分辨率的5號染色體的PC1值軌跡和Pearson相關(guān)熱圖，具有相同的read次數（每個(gè)階段2-3次生物復制）。

圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強度。數據為平均值±標準偏差，通過(guò)自舉獲得（n = 100）。通過(guò)單側t檢驗計算P值。

圖1. 人類(lèi)精子和胚胎的三維染色質(zhì)結構

2、人類(lèi)精子不包含傳統的TAD結構

先前的研究表明，TAD結構存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒(méi)有在人類(lèi)精子中觀(guān)察到典型的三角TAD結構（圖1a）。例如，人類(lèi)精子的HOXA簇區域沒(méi)有TAD邊界，但存在于人類(lèi)胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗證該觀(guān)察結果，繪制了人類(lèi)精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號方差。與小鼠精子和人類(lèi)胚泡不同，人類(lèi)精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類(lèi)精子中不存在TAD。本文進(jìn)一步比較了人類(lèi)精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結果表明，人類(lèi)精子在4 Mb（中程）附近出現一個(gè)主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現肩峰，在41 Mb左右出現遠距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線(xiàn)也有差異?？傊?，這些結果表明人類(lèi)精子不含TAD。

為了排除潛在的實(shí)驗偏見(jiàn)，本文將小鼠精子與人類(lèi)精子混合，并為精子混合物構建了一個(gè)Hi-C庫（方法）。平行地，本文混合了人類(lèi)HeLa細胞和小鼠HT22細胞。與本文之前的結果一致，本研究在精子混合物中觀(guān)察到了來(lái)自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類(lèi)HeLa細胞和小鼠HT22細胞中均觀(guān)察到TAD結構。這些數據證實(shí)了人類(lèi)精子中沒(méi)有TAD。
CTCF-cohesin復合物在高級染色質(zhì)結構中具有重要作用。本研究調查了人類(lèi)和小鼠精子中CTCF和粘著(zhù)蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復合物的一個(gè)亞基，存在于人類(lèi)和小鼠的精子中）;但是，在人類(lèi)精子中未檢測到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細胞系中表達很弱，但是在小鼠精子，人類(lèi)和對照小鼠細胞系中檢測到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會(huì )導致TAD結構的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類(lèi)精子中TAD結構喪失的基礎。

圖a 人類(lèi)精子和胚泡中HOXA簇周?chē)南嗷プ饔脽釄D，分辨率為10 kb（生物學(xué)重復; n = 3）。

圖b 人精子和胚泡中TAD信號方差與read深度（1 /讀取次數）的線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)。在y軸上標記了人類(lèi)胚泡和精子的回歸線(xiàn)的線(xiàn)性外推。在每個(gè)讀取深度進(jìn)行降采樣分析3次（n = 3）。

圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個(gè)樣品在兩個(gè)生物學(xué)獨立的重復樣本上重復實(shí)驗。

圖2. 人類(lèi)精子不包含傳統的TAD結構

3、TAD邊界的建立

TAD結構在人類(lèi)2細胞胚胎中并不明顯。但是，兩細胞胚胎中的某些區域顯示出絕緣子結合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區域大部分成為T(mén)AD邊界（圖3a）; 這些區域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中絕緣邊界的動(dòng)力學(xué)。本研究的數據表明，分別在2細胞，8細胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個(gè)絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細胞胚胎中發(fā)現了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類(lèi)樣品中2細胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結果表明2細胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數據還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當將ZGA階段的人類(lèi)邊界與小鼠的邊界進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現了TTC1和CCNG1基因周?chē)慕^緣邊界。

接下來(lái)，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區域。在2細胞階段首先獲得邊界的基因組區域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀(guān)察到了類(lèi)似的結果。這些數據表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周?chē)?。作者還發(fā)現邊界附近的管家基因的表達水平傾向于高于其他管家基因的表達水平。
據報道，重復元素與細胞系中的TAD邊界相關(guān)。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周?chē)貜驮母患?。作者的數據表明，在人?lèi)早期階段，Alu重復序列（而不是LINE或MIR重復序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周?chē)?。在小鼠胚胎中觀(guān)察到了相似的結果。例如，在人類(lèi)或小鼠RAB5A基因周?chē)?細胞階段獲得的絕緣邊界被建立在A(yíng)lu密集區。此外，作者的數據表明AluS元素在2細胞階段獲得的絕緣邊界周?chē)叨雀患▓D3e）。此外，與其他階段相比，在2細胞階段獲得的絕緣邊界周?chē)腁luS重復序列在裂解階段得到了高度表達?？傮w而言，這些結果表明，人類(lèi)胚胎中絕緣的邊界傾向定位在A(yíng)lu密集區周?chē)?br />

圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數量；b，絕緣邊界中心。

圖b 相對于胚泡邊界數，每個(gè)階段中絕緣邊界數的累積百分比。

圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗）。

圖d 累積分布函數圖，用于特定階段獲得的邊界與人類(lèi)胚胎中最接近的管家基因的距離（來(lái)自2-3個(gè)生物學(xué)重復的合并數據）。虛線(xiàn)表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗。

圖e 在人類(lèi)胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。

圖3. 在人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中建立絕緣邊界

4、TAD的建立依賴(lài)于ZGA以及CTCF調控染色體

先前的報道表明，TAD的建立獨立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調查了這些特征在人類(lèi)中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經(jīng)過(guò)α-amanitin處理的8細胞胚胎中，TAD的結構模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號的相對方差也顯著(zhù)低于未處理的8細胞胚胎（圖4b）。因此，在人類(lèi)胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來(lái)，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質(zhì)。粘著(zhù)蛋白復合物和CTCF在高階染色體結構中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質(zhì)表達的差異。粘附蛋白復合物的亞基，例如RAD21，已經(jīng)在ZGA之前在人類(lèi)胚胎中高度表達。相比之下，當在人類(lèi)胚胎中首次觀(guān)察到TAD結構時(shí)，CTCF的表達在ZGA階段之前非常有限，并且在8細胞階段急劇增加（圖4c）。在經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎中，CTCF表達受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細胞核中幾乎未觀(guān)察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經(jīng)處理的8細胞核中，但在經(jīng)α-amanitin處理的8細胞核中卻不存在（圖4d）。這些結果表明CTCF表達需要人ZGA。
接下來(lái)，作者研究了在人類(lèi)胚胎中建立TAD對CTCF的需求。作者通過(guò)將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來(lái)抑制CTCF的表達，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒(méi)有觀(guān)察到三角形TAD結構（圖4e）。相對的TAD信號方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數TAD邊界在對照morula中消失，而在siCTCF morula中變弱。因此，本研究的數據表明ZGA期間CTCF表達是人類(lèi)胚胎中TAD建立所必需的。

圖a 人8細胞和經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎中的相互作用熱圖。

圖b 人2細胞（n = 3），8細胞（n = 3）和經(jīng)α-amanitin處理的8細胞胚胎（n = 3）中TAD信號相對方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個(gè)百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對于8細胞和α-amanitin處理過(guò)的8細胞之間的所有成對比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗）。

圖c 人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中CTCF表達的動(dòng)態(tài)（來(lái)自參考文獻22的表達數據；每個(gè)階段3至20個(gè)細胞）。數據為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬(wàn)個(gè)映射讀操作的每千個(gè)轉錄本的讀操作數。

圖d CTCF在人類(lèi)胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。

圖e 跟蹤未處理的對照morula和siCTCF morula中的TAD結構，其中覆蓋了基因表達。

圖4. CTCF調控人類(lèi)胚胎中染色質(zhì)的建立

總結

盡管人類(lèi)和小鼠胚胎都顯示出高階染色質(zhì)結構的全基因組重編程，但人類(lèi)和小鼠胚胎之間的染色質(zhì)結構存在很大差異。本研究的數據為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)結構的建立提供了寶貴的資源和機制的見(jiàn)解。

文獻下載：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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