【成功案例】轉錄組+外顯子揭示Xq28重復綜合征女性患者無(wú)臨床癥狀的原因

2021年7月，百邁客和浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫院合作文章“Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing”發(fā)表于期刊Human Mutation（IF：4.878）。其中轉錄組數據差異及功能分析、外顯子測序分析等由百邁客完成，此外百邁客業(yè)務(wù)還包括單細胞轉錄組、空間轉錄組、單細胞ATAC&GEX、單細胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯(lián)系當地銷(xiāo)售。

導讀

研究背景：

Xq28重復綜合征（MDS）是一種嚴重的神經(jīng)發(fā)育障礙。癥狀和體征包括嬰兒張力過(guò)低、精神運動(dòng)發(fā)育遲緩、嚴重智力殘疾、言語(yǔ)發(fā)育不良、進(jìn)行性痙攣、反復呼吸道感染和男性癲癇發(fā)作。MDS是由甲基CpG結合蛋白2基因（MECP2）的重復（或三倍）引起的，其增加轉錄調節因子MeCP2的表達。如小鼠模型和人類(lèi)所示，MeCP2蛋白過(guò)度表達可能對大腦發(fā)育和功能產(chǎn)生有害影響。
最初，MDS被認為只在男性中出現，而大多數重復的女性是無(wú)癥狀攜帶者。然而，后來(lái)的報告顯示，20多名MECP2重復的受影響女性存在輕度至嚴重的臨床表型。

X染色體失活（XCI）是X染色體的一種轉錄沉默機制，由XIST的轉錄啟動(dòng)。XCI通過(guò)募集染色質(zhì)重塑酶復合物誘導漸進(jìn)表觀(guān)沉默。一條X染色體在女性個(gè)體中隨機失活，但一些女性表現出兩條X染色體之一的傾斜失活（shewed XCI）。傾斜的XCI可導致女性X連鎖疾病的表型異質(zhì)性。MECP2是一個(gè)受XCI影響的基因，而XCI似乎對Xq28重復女性中的MECP2表達至關(guān)重要。

結論：

本文中作者檢測了兩例無(wú)癥狀女性（母親和祖母）間質(zhì)性Xq28重復。AR（androgen receptor）和RP2（retinitis pigmentosa 2）分析表明，兩者的XCI都極為傾斜，Xq28重復染色體在母親體內失活，但在祖母體內被意外激活。有趣的是，通過(guò)結合RNA測序和全外顯子組測序，作者證實(shí)XIST僅在兩名女性的Xq28重復染色體中表達，表明Xq28重復染色體不活躍。同時(shí)，排除這兩名女性，尤其是祖母的主要臨床表型，重復X染色體中的MECP2和大多數XCI基因沒(méi)有轉錄表達或上調。作者發(fā)現，使用RNA測序檢測的XCI狀態(tài)與建立女性MECP2復制的臨床表型更相關(guān)。這表明，除了DNA甲基化之外，還有其他因素維持XCI狀態(tài)，一種可能的額外抑制機制發(fā)生在非甲基化X染色體的轉錄水平，抵消了MECP2復制的有害表型效應。

英文題目：Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing.

中文題目：轉錄組+外顯子揭示Xq28重復綜合征女性患者無(wú)臨床癥狀的原因

期刊：Human Mutation

IF：4.878

發(fā)表時(shí)間：2021.7.14

作者：Yixi Sun

材料與方法：

材料：具有典型的MECP2重復綜合征癥狀男孩患者（III.2）、其母親（II.2）、父親（II.1）、外祖母（I.2）、外祖父（I.1）；
Keywords：RNA-seq；WEX；SNP微陣列；

實(shí)驗結果

一、通過(guò)SNP陣列、qRT-PCR和FISH分析，在女性II.2和I.2中發(fā)現Xq28染色體內重復

使用SNP微陣列檢測I.1、I.2和II.2的變化。在II.2和I.2（圖1b）中，在Xq28區域和Xq27.3區域分別顯示了437KB的重復和284KB的重復，這表明Xq28和Xq27.3重復是母系遺傳的。Xq28區域包含13個(gè)在線(xiàn)孟德?tīng)柸诉z傳（OMIM）基因（包括MECP2、IRAK1、L1CAM、NAA10和HCFC1）。通過(guò)qRT-PCR以驗證結果，在男性I.1中檢測到MECP2和IRAK1一個(gè)基因劑量的拷貝，而在正常對照女性中檢測到兩個(gè)拷貝，在I.2和II.2中檢測到三個(gè)拷貝（圖1c，d）。對女性I.2和II.2的中期染色體進(jìn)行FISH分析，發(fā)現含有MECP2的探針RP11-119A22僅在Xq28處有信號，這表明Xq28重復是串聯(lián)的，沒(méi)有整合到基因組的其他地方（圖1e，f）。

圖1

二、AR和RP2分析表明，女性I.2和II.2具有極度傾斜的XCI

作者進(jìn)行了基于PCR的AR和RP2分析，以評估外周血中的XCI模式。使用甲基化敏感的限制性?xún)惹忻窰paII，使PCR只擴增非活性X染色體上的等位基因。通過(guò)分離分析確定了失活X染色體的起源。

II.2的未消化PCR產(chǎn)物給出了每個(gè)標記的兩個(gè)峰（AR為267/287，RP2為359/381）。HPAII消化產(chǎn)物（圖2c和2f）觀(guān)察到一個(gè)代表287個(gè)AR（359個(gè)RP2）的主峰，這表明失活等位基因遺傳自I.2。對I.2的未消化PCR產(chǎn)物的分析給出了兩個(gè)峰（AR為281/287，RP2為359/374）。通過(guò)分析HpaII消化產(chǎn)物（圖2b和2e）檢測到的主峰（AR為281，RP2為374）與II.2失活產(chǎn)物等位基因中的主峰不同。這些結果表明，在母親II.2和祖母I.2中發(fā)現了XCI的極端傾斜，這與失活X染色體不同（圖2）。AR PCR產(chǎn)物的287 bp峰值、II.2中RP2 PCR產(chǎn)物的359 bp峰值以及Xq28重復來(lái)自祖母I.2，它們與相同的X染色體相連。然而，該等位基因在A(yíng)R PCR后峰值為287 bp，RP2 PCR后峰值為359 bp，Xq28重復，在II.2中失活，但在I.2中激活。

圖2

三、使用外顯子組測序在I.2中未檢測到X染色體上沒(méi)有Xq28重復的其他潛在致病性變體

根據AR和RP2分析的結果，I.2中的MECP2重復應該位于活躍的X染色體上。如果兩條X染色體都有缺陷，則具有更有害變體的突變X染色體將完全失活，以避免其不良反應，迫使另一條變得活躍。因此，對于I.2，假設在沒(méi)有Xq28重復的X染色體上存在額外的更有害的致病性變體，從而迫使Xq28重復變得活躍。

微陣列結果中顯示，除了Xq28和Xq27.3重復外，在I.2和II.2中未發(fā)現致病性拷貝數變異。為了進(jìn)一步探索其他變體，作者對女性I.2和II.2的DNA進(jìn)行外顯子組測序，在I.2和II.2中篩選了X染色體上OMIM基因的不同變體，特別是在I.2中沒(méi)有Xq28重復的X染色體上的變異。結果顯示，X染色體上有12個(gè)變異，包括一個(gè)無(wú)義變體和11個(gè)錯義變體。只有三個(gè)基因（NR0B1、DMD和USP9X）與疾病有關(guān)，根據ACMG指南，所有變異均不符合“致病性”或“可能致病性”的分類(lèi)（Richards等人，2015）。沒(méi)有證據表明這些變體比Xq28復制品更有害?？傊?，在I.2中未發(fā)現可導致繼發(fā)性?xún)A斜的其他潛在致病性變體。

四、對于II.2和I.2，XIST中的雜合SNP 僅在具有Xq28重復的X染色體中表達，這表明Xq28重復染色體不活躍

為了確定可能導致I.2原發(fā)性?xún)A斜的原因，作者對外周血單個(gè)核細胞（PMBC）進(jìn)行了RNA測序；通過(guò)外顯子組測序，作者在I.2和II.2的XIST區域附近鑒定了8個(gè)SNP。對于I.2和II.2，沒(méi)有發(fā)現XIST的所有SNPs存在差異，也沒(méi)有證據表明這些變體會(huì )影響XCI的初始過(guò)程。在I.2中，沒(méi)有Xq28重復的X染色體上沒(méi)有假定的主要傾斜原因。

作者還使用基于配對RNA-seq和DNA-seq數據的XIST酶的度量來(lái)量化XCI的傾斜程度。結果表明，rs144237473（NC_000023.11:g.73846325）（g:0/A:288）的雜合等位基因在II.2的純合條件下表達，這是母體遺傳。類(lèi)似地，I.2中rs144237473（G:0/A:291）的等位基因表達極度傾斜。作者還通過(guò)Sanger測序驗證了DNA和cDNA中的SNP（圖3a）。對于I.2和II.2，在rs144237473（NC_000023.11:G.73846325）位置檢測到G/A變體，但在cDNA水平上僅檢測到從I.2遺傳的帶有“A”的等位基因。XIST作為一種X-非活性特異轉錄本，僅在非活性X-染色體上表達。II.2的Xq28重復染色體也遺傳自I.2。結果顯示，每一位女性的非活動(dòng)X(jué)染色體都是與Xq28重復相同的染色體。

圖3

五、RNA測序顯示兩名女性的Xq28重復等位基因上的MECP2和IRAK1沒(méi)有轉錄表達

X連鎖基因的XCI狀態(tài)被定義為逃逸、可變逃逸和失活。XCI基因，如MECP2和IRAK1，僅在活躍的X染色體上表達。II.2和I.2中XCI基因（MECP2、IRAK1、TMEM187和TKTL1）的所有SNP表達均處于純合狀態(tài)，表明II.2和I.2中的XCI極為傾斜。在Xq28重復區域中，有幾個(gè)信息可以確定親本來(lái)源的單核苷酸多態(tài)性，如MECP2（NC_000023.11:g.154030040）、IRAK1（NC_000023.11:g.154013378等。結果表明，從祖母I.2遺傳的等位基因（具有Xq28重復）沒(méi)有轉錄表達。同樣，在可變的XCI基因HCFC1、NAA10和逃逸的XCI基因RENBP中，母親從I.2遺傳的重復等位基因表達較低。圖4 中顯示的XCI基因的信息性SNP，發(fā)現XCI基因MECP2和IRAK1在Xq28II.2和I.2的重復等位基因在轉錄中沉默。

圖4

圖5

通過(guò)PMBCs中的RNA-seq，作者比較了兩名MECP2重復的女性和兩名年齡匹配的對照女性之間的差異表達。然后重點(diǎn)研究了跨基因的基因轉錄Xq28——II.2和I.2中的重復區域；MECP2和IRAK1基因的表達劑量在II.2和I.2之間無(wú)顯著(zhù)差異。另外，還通過(guò)RT-qPCR檢測了具有Xq28重復的家族成員和年齡匹配的正常人中MECP2和IRAK1的mRNA（圖5）。與年齡匹配的男性對照組相比，III.1中MECP2和IRAK1的表達劑量顯著(zhù)升高（平均分別為4.6倍和5.2倍），而與年齡匹配的女性對照組相比，Xq28復制女性I.1和II.1中的劑量沒(méi)有顯著(zhù)上調。

總結

作者通過(guò)對Xq28重復（涉及MECP2）女性（母親和祖母）進(jìn)行轉錄組和全外顯子測序。僅從AR和RP2分析判斷，I.2應該有相關(guān)的臨床表型，并且MECP2基因表達上調，但I.2是無(wú)癥狀攜帶者。作為59歲的女性，I.2可能發(fā)生與年齡相關(guān)的XCI傾斜。通過(guò)AR分析，在55-60歲以上人群的橫斷面研究中，XCI的傾斜度隨著(zhù)年齡的增長(cháng)而顯著(zhù)增加，但有趣的是，Swierczek等人通過(guò)一種新的XCI分析轉錄分析，發(fā)現老年女性的傾斜度沒(méi)有增加。甲基化水平和轉錄水平檢測到的XCI狀態(tài)不一致。

作者的結果相似，通過(guò)結合RNA-seq和RT-PCR，發(fā)現在非活性X染色體上特異表達的X-非活性特異轉錄物XIST僅在I.2和II.2的Xq28重復染色體上表達。這表明Xq28重復染色體是不活躍的。另外還發(fā)現，兩個(gè)女性的Xq28重復等位基因上的MECP2和IRAK1（受XCI影響的基因）沒(méi)有轉錄表達。這解釋了為什么這兩名女性，特別是I.2，是無(wú)癥狀攜帶者。同時(shí)，作者推測，除了DNA甲基化之外，其他因素也在維持XCI狀態(tài)，一種額外的抑制機制可能發(fā)生在非甲基化X染色體的轉錄水平，以抵消MECP2復制的有害表型效應。根據XCI，作者的發(fā)現為MECP2重復綜合征知識及其在女性中的表型后果增加了新的見(jiàn)解，這對遺傳和產(chǎn)前咨詢(xún)具有重要意義。

原文鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34273908

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