百邁客全轉錄組產(chǎn)品優(yōu)勢
百邁客全轉錄組測序服務(wù)是一次檢測，獲得四種分子（mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）信息，針對不同類(lèi)型的RNA進(jìn)行表達分析，結構研究以及全新轉錄本的發(fā)現，并結合競爭性?xún)仍碦NA（ceRNA）機制，進(jìn)行聯(lián)合分析，深入挖掘轉錄水平調控網(wǎng)絡(luò )，深度探究各類(lèi)RNA分子的調控機制。分析內容如下：
導讀
circRNA在多種生理過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用，因此許多疾病與circRNA有關(guān)，特別是癌癥。前期已有大量研究發(fā)現肝細胞癌（HCC）中circRNA表達普遍下調，pre-mRNA 3′ 末端復合物參與circRNA環(huán)化并在 HCC 腫瘤發(fā)生中起重要作用。因此，本研究探索了CPSF4在circRNA 3′ 末端形成和剪切中的作用。臨床研究表明，CPSF4在HCC中表達上調，CPSF4的高表達與HCC患者的不良預后相關(guān)。機制研究表明，CPSF4導致具有多聚腺苷酸化信號序列的circRNA降低，這類(lèi)circRNA的減少導致miRNA的降低并破壞了HCC中miRNA介導的基因沉默。細胞培養和異種移植小鼠模型的實(shí)驗表明，CPSF4促進(jìn)HCC細胞的增殖并增強致瘤性。綜上，在HCC中CPSF4通過(guò)抑制circRNA和破壞miRNA介導的基因沉默引發(fā)癌癥。
實(shí)驗方法
材料：5位術(shù)前未經(jīng)治療的HCC患者癌組織和癌旁組織樣本；TCGA數據庫數據
方法：轉錄組測序、circRNA測序、細胞遷移實(shí)驗、生存分析
研究結果
1、circRNAs在HCC組織中下調
為了探索HCC中的circRNA表達譜，本研究分析了幾個(gè)公開(kāi)可用的數據，包括GSE94508、GSE97332和GSE14520，結果顯示在3個(gè)GEO數據庫中，HCC的circRNA表達水平下降。盡管通過(guò)選擇性剪接和多聚腺苷酸化導致廣泛的RNA縮短是癌癥中的常見(jiàn)現象，但circRNA的長(cháng)度分布沒(méi)有改變，并且所有長(cháng)度的circRNA表達水平都下降。PAS序列是多聚腺苷酸化剪切的核心元件，分析表明HCC組織中的circRNA無(wú)論是否含有PAS序列均顯著(zhù)下調。然而，在3個(gè)GEO數據庫中，含有PAS的circRNA的平均水平顯著(zhù)低于不含PAS的circRNA，這表明PAS介導的剪切在circRNA形成中起重要作用。綜上所述，HCC組織中circRNAs整體減少，PAS介導的RNA裂解可能是導致circRNA下調的原因之一。
2、CPSF4高表達與HCC患者的不良預后相關(guān)
由于CPSF4表達在HCC中顯著(zhù)增加，并且其高水平表達對應于HCC中OS的最高風(fēng)險，因此本研究將重點(diǎn)放在CPSF4上。通過(guò)比較50對配對的序列數據，發(fā)現HCC腫瘤組織中CPSF4表達水平顯著(zhù)高于正常鄰近組織。來(lái)自GSE49515的微陣列數據還表明，10名HCC患者的外周血單核細胞（PBMC）樣本中的CPSF4水平顯著(zhù)高于10名健康對照，這表明CPSF4可以作為HCC診斷的生物標志物（圖 1A）。Kaplan-Meier對364例患者的生存分析顯示，5 年生存率從 CPSF4低表達患者的57%±5%下降到CPSF4高表達患者的42%±5%（p < 0.01，圖 1B）。進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，CPSF4與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著(zhù)相關(guān)（圖 1C）。單變量分析表明HCC患者的OS率與高CPSF4表達之間存在關(guān)聯(lián)（p < 0.01）。多變量Cox回歸分析顯示CPSF4水平（p = 0.03）是OS的獨立預后因素（圖 1D）。
通過(guò)對臨床標本的分析進(jìn)一步驗證了生物信息學(xué)結果。本次檢測的5個(gè)樣本中，CPSF4的蛋白質(zhì)印跡顯示，與癌旁組織相比，HCC癌組織中表達更高（圖 1E）。此外，細胞系中CPSF4的蛋白水平也顯示CPSF4在所有HCC細胞系（Hep3B、Bel7402、Huh7、HepG2和Bel7404）中均高表達，但在正常肝細胞L02中幾乎檢測不到（圖 1F）。在5個(gè)HCC細胞系中，HepG2的CPSF4表達水平最高，而B(niǎo)el7402的水平最低。在Bel7402和HepG2細胞中構建了CPSF4敲低和過(guò)表達細胞，但由于Bel7402中的CPSF4表達非常低，所以無(wú)法檢測到Bel7402-KD細胞中的敲低效率；雖然HepG2中的CPSF4表達非常高，但在HepG2-OE細胞中的過(guò)表達效率也非常低。因此，大部分CPSF4 KD實(shí)驗是在HepG2細胞中完成的，而大部分CPSF4 OE實(shí)驗是在Bel7402細胞中完成的。由41對組織樣本組成的人類(lèi)HCC組織微陣列的免疫組化（IHC）染色結果也證實(shí)了HCC組織中CPSF4的上調。在41個(gè)患者中，25個(gè)HCC組織表現出CPSF4高表達。相比之下，大多數癌旁組織顯示出弱或中等的CPSF4表達（圖 1G）。相關(guān)性分析還表明，CPSF4表達與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著(zhù)相關(guān)（圖 1H）。
圖1 CPSF4在HCC組織中高表達，并提示HCC患者預后不良
3、CPSF4降低HCC細胞中circRNA的表達水平
由于CPSF4負責PAS剪切，因此本研究假設CPSF4的增加加速了circRNA的降解并降低了它們在HCC細胞中的水平。為了驗證這一假設，提取CPSF4-KD HepG2細胞、CPSF4-OE Bel7402細胞及其陰性對照的總RNA，并通過(guò)高通量測序進(jìn)行分析。結果顯示，在CPSF4-OE細胞中檢測到下調circRNA（1058）多于上調circRNA（821），并且circRNA的平均表達水平顯著(zhù)降低。相比之下，CPSF4-KD細胞中大多數circRNA（5005個(gè)circRNA中的3221個(gè)）上調，circRNA的平均表達水平顯著(zhù)增加（圖2A，B）。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現，CPSF4主要抑制外顯子circRNA，只有一小部分circRNA是內含子或內含子-外顯子circRNA。CPSF4-OE細胞和CPSF4-KD細胞中circRNA的長(cháng)度分布均未改變（圖 2C），但CPSF4調節后的circRNA變化依賴(lài)于PAS。首先，在4種細胞系中，含有PAS的circRNA的表達顯著(zhù)低于不含PAS的circRNA；其次，CPSF4-KD細胞含有PAS序列的circRNA明顯上調，但在沒(méi)有PAS序列的circRNA中沒(méi)有檢測到變化（圖 2D）。而在CPSF4-OE細胞中帶有或不帶有PAS序列的circRNA都減少了，推測在高表達水平CPSF4的存在下，除了6個(gè)傳統PAS序列之外的一些非特異性PAS序列也可以被剪接。
為了驗證，本研究首先從GEO數據庫中選擇了HCC組織中807個(gè)下調的circRNA（FC>2，p<0.05）；然后從RNA-seq數據中篩選了1447個(gè)在CPSF4-OE細胞中下調或在CPSF4-KD細胞中上調的circRNA。這兩組數據取交集，共得到24個(gè)circRNA作為驗證的候選circRNA；結構分析表明其中16個(gè)含有PAS序列。實(shí)時(shí)PCR結果顯示，這16個(gè)circRNA中有13個(gè)在CPSF4-OE細胞中被抑制，但在CPSF4-KD細胞中被激活（圖 2E）。選擇2個(gè)帶有PAS元件的circRNA，hsa_circ_0027774 和 hsa_circ_0004913 作為CPSF4靶向的circRNA；同時(shí)，另一個(gè)廣泛研究的不含PAS元件的circRNA hsa_circ_0001946作為CPSF4非靶向circRNA。Northern blot結果表明hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913與CPSF4呈負相關(guān)，但hsa_circ_0001946在所有細胞系中保持相同水平（圖 2F）。同時(shí)構建了這三種circRNA的OE質(zhì)粒并與CPSF4 OE或KD質(zhì)粒共轉染，real-time PCR結果顯示帶有PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）與CPSF4水平呈負相關(guān)，而不含PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）不受CPSF4的影響（圖 2G），這說(shuō)明CPSF4在轉錄后抑制了circRNA?？傊?，CPSF4直接調節HCC細胞中帶有PAS元件的circRNA的表達。
圖2 CPSF4可減少HCC細胞中的circRNA生物合成
4、CPSF4介導的circRNA減少可以導致miRNA的減少并破壞miRNA介導的基因沉默
為了測試CPSF4介導的circRNA減少是否會(huì )影響miRNA的穩定性，從CPSF4-OE和CPSF-KD細胞中提取總miRNA，結果顯示CPSF4-OE細胞中miRNA（4-40 nt）和tRNA（40-80 nt）的比率降低，但在CPSF4-KD細胞中增加（圖 3A-C），這證實(shí)了CPSF4能夠減少miRNA的積累。
與其他癌癥一樣，HCC中的miRNA表達水平整體下降。大多數下調的miRNA與本研究之前篩選的807個(gè)下調的circRNA互補。選擇與hsa_circ_0004913部分互補的hsa-miR-383-5p、hsa-miR-142-5p，以及與hsa_circ_0027774部分互補的hsa-miR-450b-3p和hsa-miR-145-5p作后續分析。實(shí)時(shí)PCR顯示4種miRNA在CPSF4-KD細胞中均增加，而在CPSF4-OE細胞中減少（圖 3D）。HepG2細胞中的circRNA探針證實(shí)hsa-miR-145、hsa-miR-450b與hsa_circ_0027774結合，而hsa-miR-142、hsa-miR-383與hsa_circ_0004913結合。AGO2免疫沉淀（RIP）結果顯示hsa_circ_0004913、hsa_circ_0027774及其結合的miRNA在A(yíng)GO2抗體相關(guān)復合物中特異性富集，但在對照IgG中沒(méi)有富集。在CPSF4-KD細胞中，與對照相比hsa_circ_0004913/has-miR-383和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145對增加；但在CPSF4-OE細胞中減少，這表明CPSF4介導的circRNA減少也影響了miRNA的積累。miR-383直接靶向HCC中的PARP2，而PARP2參與HCC的發(fā)展；miR-145直接靶向CDCA3，CDCA3降低了HCC患者的生存時(shí)間。熒光素酶測定證實(shí)miR-145可以沉默CDCA3的表達，miR-383可以沉默PARP2的表達。生物信息學(xué)分析顯示，PARP2的3′-UTR中有2個(gè)miR-383結合位點(diǎn)，CDCA3的3′-UTR 中有2個(gè)miR-145結合位點(diǎn)。此外，這2個(gè)基因在HCC中均過(guò)表達，并與HCC患者較短的OS相關(guān)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測，發(fā)現PARP2和CDCA3蛋白也在CPSF4-KD細胞中降低，而在CPSF4-OE細胞中增加（圖 3E）。此外，這2種蛋白的表達與HCC中CPSF4的表達呈正相關(guān)。所有這些數據都證實(shí)了CPSF4介導的circRNA減少破壞了miRNA介導的基因沉默。
圖3 CPSF4減少了miRNA的積累和基因沉默
5、CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用
在Bel7402和HepG2細胞中生成hsa_circ_0004913-OE細胞，然后用CPSF4質(zhì)粒轉染。分別通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)PCR檢測每個(gè)細胞系中的CPSF4蛋白和hsa_circ_0004913表達水平（圖 4A，B）。與對照細胞相比，hsa_circ_0004913-OE細胞顯示出較慢的增殖和較低的克隆形成。然而，CPSF4的OE可以消除hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用，因為CPSF4轉染后生長(cháng)速度和克隆形成能力恢復（圖 4C，D）。這些結果表明circRNA在CPSF4介導的HCC細胞腫瘤發(fā)生中的重要作用。
圖4 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用
文獻下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34103682
百邁客第八屆全國功能基因組學(xué)高峰論壇
1 峰會(huì )介紹
第八屆全國功能基因組學(xué)高峰論壇將于2021年10月18-22日震撼開(kāi)啟。該峰會(huì )是中國基因產(chǎn)業(yè)具有影響力的行業(yè)峰會(huì )之一，為展示我國功能基因組學(xué)在多組學(xué)和大數據背景下重大研究進(jìn)展，促進(jìn)功能基因組學(xué)各研究領(lǐng)域的交流與合作，加強行業(yè)信息與資源的共享以及成果轉化，特舉辦本次高峰論壇，論壇規模逾1000人，在高通量測序技術(shù)、多組學(xué)分析方法及生物云蓬勃發(fā)展的背景下，本屆大會(huì )將邀請各界領(lǐng)域領(lǐng)軍者共同探索功能基因組學(xué)的新技術(shù)和新思路，以及大數據時(shí)代下的功能基因組學(xué)發(fā)展方向與未來(lái)！
2 峰會(huì )亮點(diǎn)
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? 深度探討 對話(huà)學(xué)者，零距離面對面深度探討
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? 現場(chǎng)體驗 百邁客生物云平臺動(dòng)手實(shí)驗室現場(chǎng)體驗
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