單細胞多組學(xué)占領(lǐng)高分“陣地”- 人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉錄和表觀(guān)基因組特征

為了研究人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉錄組學(xué)，對18例患者(男性77%)的頸動(dòng)脈內膜切除組織進(jìn)行了酶消化，通過(guò)熒光激活細胞分選(FACS；圖1A)分離出活的有核細胞，并制備了scRNA-seq文庫。在根據報告基因的數量過(guò)濾細胞后，我們對3282個(gè)細胞進(jìn)行了無(wú)偏聚類(lèi)，確定了14個(gè)細胞群體(圖1B和1C)。我們的scRNA-seq數據與大量RNA-seq數據的相關(guān)性，以及患者間群集分布的變異，證實(shí)了數據的一致性，但患者1除外。

我們觀(guān)察到3個(gè)非免疫細胞簇(簇8，9和10；表達CD34和ACTA2[肌動(dòng)蛋白α2，平滑肌])和11個(gè)白細胞簇(圖1B和1D)。后者包括5個(gè)淋巴細胞簇(第0、1、3、4、11簇；表達CD3E、CD4、CD8、CD79A)，5個(gè)髓系簇(第5、6、7、12和13簇；表達CD14、CD68、KIT)，和1個(gè)沒(méi)有明確的細胞類(lèi)型表達譜的混合細胞的簇(第2簇)，但與其他簇有相似的基因表達，似乎主要含有凋亡的髓系細胞和T細胞(圖1B和1D)。T細胞是我們數據集中豐富的群體，占所有分析細胞的52.4%，而髓系群體占所有細胞的18.5%。

圖1

對ECs群集進(jìn)行分離和重新聚類(lèi)后，發(fā)現了4個(gè)不同的子類(lèi)(E.0-E.3，圖2A)。我們通過(guò)標記基因將EC表型分為不同的亞類(lèi)(圖2B)。在E0小鼠中，ACKR1有明顯的表達，ACKR1與靜脈內皮細胞和血管相關(guān)，PRCP參與了血管生成和受損內皮細胞的再生(圖2B和2C)。E.1表達細胞外基質(zhì)基因，E.2表達細胞遷移標記FGF18和HEG1，這兩個(gè)群體都表達VCAM1，它在激活的內皮細胞表達，促進(jìn)白細胞(如單核細胞和T細胞)的黏附和遷移(圖2C)。這表明E.0、E.1和E.2代表著(zhù)激活的內皮細胞，它通過(guò)細胞黏附和新生血管以及介導白細胞外滲，積極活躍地加重晚期病變的炎癥。值得注意的是，E.3亞群表達典型的SMC標記物，如ACTA2、NOTCH3和MYH11 (圖2C)。

EC簇之間的聚集以及SMC相關(guān)通路的富集(圖2D)，表明這個(gè)亞群可能正在經(jīng)歷內皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉變，或者反之亦然。為了驗證這些發(fā)現，我們觀(guān)察了ACTA2和CD34在連續的組織學(xué)切片上的表達(圖2E)。

圖2

第8簇代表SMCs，分為2個(gè)亞類(lèi)：一簇具有收縮特性的SMC(簇S.1；表達MYH11、ACTA2和TAGLN)和一簇合成型的SMCs(簇S.0；表達COL1A1、MGP和COL3A1。S0簇中典型的SMC標志物的低表達和細胞外基質(zhì)基因的上調表明，這些細胞一部分來(lái)自斑塊已建立的帽狀部分。這一簇中的有限數量的細胞是KLF4⁺，這表明血管平滑肌細胞分化為合成的或巨噬細胞樣表型。

為了更詳細地定義T細胞，我們分離和重新聚類(lèi)CD4⁺T細胞，發(fā)現了5個(gè)亞類(lèi)(CD4.0-CD4.4，圖3A)，其中主要的區別是它們的激活狀態(tài)，而不是通常用于定義CD4⁺T輔助亞群的轉錄因子和細胞因子(圖3B和3C)。CD4.0和CD4.1具有細胞毒基因表達譜，此外，這一簇中的基因表達證實(shí)了與適應性免疫反應相關(guān)的促炎通路的富集（圖3D)。

根據經(jīng)典標記物FOXP3(轉錄因子P3)、IL2RA(CD25)和CTLA4的表達(圖3B)，最終的CD4⁺亞類(lèi)(CD4.3)被鑒定為調節性T細胞簇。對CD8⁺T細胞的分析揭示了3個(gè)亞類(lèi)，它們與由激活狀態(tài)不同定義的CD4⁺T細胞相似。這表明最近T細胞受體(TCR)被激活，表明CD8⁺T細胞亞群對斑塊特異性抗原有反應，可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機制更相關(guān)。

圖3

我們分離和重新聚類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化性髓系細胞，揭示了5種不同的表型(My.0-My.4，圖4A)。My.0、My.1和My.2很可能代表不同激活狀態(tài)的巨噬細胞。促炎標志物基因(圖4B)以及免疫和炎癥通路的富集結果(圖4C)表明，My.0和My.1亞類(lèi)由促炎巨噬細胞組成。My.0顯示了最近招募的巨噬細胞的特征(圖4C，D)，表明共表達的炎癥體被激活(圖4B)。與My.0和My.1相比，My.2缺乏明顯的促炎標志物，并顯示巨噬細胞和泡沫細胞的跡象。

為了進(jìn)一步確定這3個(gè)亞類(lèi)的特征，我們接下來(lái)通過(guò)獨創(chuàng )性的通路分析(圖4E)研究了每個(gè)群體差異富集的通路(圖4D)，以及可能管理這些群體的上游調節因子。My.0和My.1顯示典型炎癥和免疫通路的富集，清楚地表明細胞激活、募集和免疫細胞相互作用驅動(dòng)了它們的表型。同時(shí)預測My.0和My.1主要受促炎因子控制，如IL1A、干擾素(干擾素)A、IFNG和IL1B。

總之，這證實(shí)了我們分別為My.0和My.1定義的最近遷移和嵌入的炎癥表型，并與我們在My.2中看到的泡沫表型相匹配。它還展示了人類(lèi)患者和小鼠模型在細胞類(lèi)型多樣性方面的良好一致性。

圖4

接下來(lái)，我們基于CellPhone?DB v2.0檢查了不同細胞類(lèi)型之間潛在的配體-受體相互作用，以預測病變內的細胞間通訊。淋巴細胞和肥大細胞的潛在相互作用的絕對數低，而髓系細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的相互作用的絕對數高(圖5A)。

隨后，我們按髓系配體(圖5B)和受體(圖5C)明確地檢查了髓系群體中獨特的相互作用。發(fā)現了多種趨化作用，包括內皮ACKR1與髓系來(lái)源的CCL2、CXCL8、CCL8和CXCL1的相互作用，其中最后兩個(gè)配體在My.1中特異性表達。我們還觀(guān)察到在所有髓系亞群中的CSF1R，與在內皮細胞、平滑肌細胞、肥大細胞和髓系細胞中的CSF1有相互作用。

圖5

利用scATAC-seq，我們檢測了人類(lèi)斑塊中髓系和T細胞的開(kāi)放染色質(zhì)啟動(dòng)子和增強子圖譜。我們用scATACseq鑒定了4個(gè)髓系細胞簇和5個(gè)T細胞簇 (圖6A和6B)。巨噬細胞(CSF1R，IL1B)和T細胞特異性基因(NKG7)的開(kāi)放染色質(zhì)，以及巨噬細胞和T細胞(SPI155和ETS156)的細胞型TFs的motif的富集，明確了細胞類(lèi)型之間的劃分界限(圖6C和6D)。轉移的髓系群體被重新聚類(lèi)，類(lèi)似于scRNA-seq簇(圖6E)。

IRF4已被證明是CD1c⁺樹(shù)突狀細胞特異性轉錄調節因子，其motif確實(shí)在My.3中富集(圖6F)。與scRNA-seq數據一致，My.1顯示了促炎因子motif的富集(圖6F)，這與在這些細胞中看到的促炎基因表達相匹配。在scATAC-seq數據中，My.0細胞特異性地富含NFATC3 的motif(圖6F)，這是一種先前被認為與激活的TLR通路信號有關(guān)的TF。My.2細胞富含抗炎的泡沫細胞相關(guān)的TFs，這和scRNA數據中是相似的。

我們觀(guān)察到含有KLF4的motif位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性增加，被證明實(shí)現了抗炎巨噬細胞激活狀態(tài)，并參與血管平滑肌細胞向巨噬細胞的轉化(圖6F)。

圖6

我們將317個(gè)CAD相關(guān)的基因與3876個(gè)差異表達基因進(jìn)行了交集，共有74個(gè)基因。同時(shí)觀(guān)察到GWA的連鎖基因在3、8和14模式中顯著(zhù)積累(圖7B)。模式3中的基因與EC簇9和10中的高表達相關(guān)(圖7C)，模式8的特點(diǎn)是有與4個(gè)巨噬細胞群相關(guān)的基因表達(圖7A)，包含AMPD2、CTSS、IL6R、CAPG、GPX1、GNAI2、TRIB1、SH2B3、FES、C19orf38和Vasp(圖7B和7D)。模式14中基因的高表達主要與平滑肌細胞群8和CD34⁺EC第10簇群體相關(guān)(圖7E)。我們的結果表明，巨噬細胞、平滑肌細胞和內皮細胞是功能測試的出發(fā)點(diǎn)。

?圖7