CELL | 空間轉錄組技術(shù)輔助揭示阿爾茲海默癥中淀粉樣蛋白斑誘導的轉錄組改變

?在A(yíng)D的過(guò)往研究中，大家發(fā)現淀粉樣斑塊周?chē)嬖趶碗s的炎性樣改變，但我們對這種反應的分子變化和細胞間的相互作用知之甚少。本文利用空間轉錄組技術(shù)研究一個(gè)AD小鼠模型，可以分辨淀粉樣斑塊周?chē)睆綖?00μm的組織結構域轉錄變化。實(shí)驗數據證實(shí)了一個(gè)早期髓鞘和OLIGs富集的基因共表達網(wǎng)絡(luò )變化，以及一個(gè)涉及補體系統、氧化應激、溶酶體、炎癥的PIGs多基因共表達網(wǎng)絡(luò )。作者進(jìn)一步通過(guò)人鼠大腦切片的原位測序在細胞水平證實(shí)了觀(guān)察到的大部分改變?？梢哉f(shuō)全基因組空間轉錄組分析為AD和其他腦部疾病提供了一種方法來(lái)解密致病特征附近的細胞網(wǎng)絡(luò )異常。

研究背景

NGS技術(shù)飛速發(fā)展，在生理和病理方面定義細胞狀態(tài)得到巨大進(jìn)步。例如，在A(yíng)D領(lǐng)域，我們現在知道小膠質(zhì)細胞對β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊表現出典型的活化反應。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞比小膠質(zhì)細胞更難分離，但單細胞核是一個(gè)合適的選擇。這些細胞的胞質(zhì)mRNA不能很好的展示，而且解離手段誘導了人為的表達改變?；镜膯?wèn)題還是，丟失了大部分的空間信息，包括細胞和淀粉樣蛋白斑的關(guān)系。而空間轉錄組可以解決這一問(wèn)題，它的空間標簽陣列可以記錄測序分子的空間位置，無(wú)偏地分析組織上的轉錄本信息。

目前AD研究的一個(gè)中心問(wèn)題是淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)退行性進(jìn)程的關(guān)系。這個(gè)斑塊可能是AD的觸發(fā)器或者驅動(dòng)器。遺傳分析表明，散發(fā)性AD的風(fēng)險與小膠質(zhì)細胞中表達的對淀粉樣蛋白沉積有響應的基因有關(guān)，但是星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞也對蛋白斑有分子響應?！癆D的細胞相變”研究致力于綜合地了解這些細胞間漸變的復雜相互作用，這也確定了Aβ沉積引發(fā)的致病結果。然而，我們對淀粉樣斑塊附近細胞中發(fā)生的分子變化依然知之甚少。

 

研究方法

一、?實(shí)驗材料

人組織：AD晚期和正常對照大腦，女性（75歲左右）

鼠：?App^NL-G-F?KI、C57BL/6J，雄性

二、?實(shí)驗技術(shù)

空間轉錄組測序、原位測序

三、?實(shí)驗流程

實(shí)驗結果

作者使用3、6、12、18月齡的App^NL-G-F和C57BL/6小鼠大腦進(jìn)行冷凍切片，每只切三片，外側做免疫組化，中間做ST（圖1A）。每個(gè)冠狀切面包含500多個(gè)TDs的轉錄譜，20個(gè)切片合計10327個(gè)轉錄譜。并對每個(gè)TD進(jìn)行了空間、病理和細胞信息的注釋。實(shí)驗中每個(gè)TD檢測到31283± 7,441個(gè)唯一分子標簽和6,578 ± 987唯一基因。作者將每個(gè)冠狀切片與艾倫小鼠大腦圖譜鑒定的14個(gè)解剖大腦區域進(jìn)行匹配(圖1B),并且每一個(gè)TD都被分配其中。TDs的數量介于112（內嗅皮層ENTI）和2114（丘腦TH）之間（圖1B）。最后將三張切片整合，用Aβ負荷（6E10染色）、反應星形膠質(zhì)細胞（GFAP）、神經(jīng)元（NeuN）以及細胞核（DAPI）對其進(jìn)行注釋。

 

圖1 | 成年小鼠大腦的空間轉錄圖譜

 

一、?成年小鼠大腦的空間轉錄組結果

作者對10327個(gè)轉錄譜進(jìn)行t-SNE分析聚類(lèi)（圖1C），并且對年齡和基因型也進(jìn)行了很好的區分（圖1D）。分區結果表明了ST技術(shù)可以清晰地分辨出大腦解剖區域。野生型（WT）的斑點(diǎn)在12月齡和18月齡有所重疊（圖1D紫色和紅色），而App^NL-G-F的轉錄譜在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)一直改變（黃色和綠色），這也與這段時(shí)期的病理進(jìn)展一致。

二、?將基因表達變化與Aβ沉積進(jìn)行關(guān)聯(lián)

App^NL-G-F小鼠的淀粉樣沉積從3月齡左右開(kāi)始（圖2A）。在18月齡的切面上，78.5–4,950 μm²區域內有1,565 ± 167個(gè)斑塊。單個(gè)TD的直徑是100 μm,切片厚度也是100 μm。因此，有理由認為中間切片的細胞接觸到了鄰近切片檢測到的淀粉樣斑塊。作者使用一個(gè)TD上的Aβ像素熒光強度的標準偏差作為Aβ指標。這種方式可以區分輕微的和強烈的Aβ堆積（圖2B）。作者平均了每個(gè)腦區TD的Aβ指標（圖2C），這與Aβ免疫染色一致，說(shuō)明Aβ從背部往腹部皮層、丘腦、海馬區進(jìn)展。

為了解基因表達的變化，作者進(jìn)行了兩個(gè)差異表達分析。首先比較App^NL-G-F?和 C57BL/6（基因模型），其次是Aβ沉積對基因表達的影響（Aβ模型）。作者使用6個(gè)轉錄本進(jìn)行經(jīng)典的RNA原位雜交實(shí)驗來(lái)驗證Aβ模型（圖2D&E），根據模型，18月齡的App^NL-G-F，Cst7，Cd68，C1qa，Slc1a3，Clu和Mbp表達異常。在圖2D中可以看到,ST的數據和RNA原位雜交數據高度相關(guān)，這也證實(shí)了本方法的有效性。

具有相似表達模式的基因很可能擁有相似的功能，因此可以通過(guò)加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析（WGCNA）進(jìn)行模塊聚類(lèi)。作者研究了10327個(gè)轉錄譜中變化程度*大的50%的基因，識別出12個(gè)模塊，并使用GOrilla提取了可能的生物學(xué)功能、Aβ暴露的表達變化、3月齡和18月齡的基因型、細胞特征、受影響的腦區。

三、?PIG模塊的鑒定

WGCNA分析中紫色的模塊被稱(chēng)為PIGs，在18個(gè)月齡時(shí)，它在A(yíng)β和基因型軸上*活躍（圖S3B）。這個(gè)模塊包含57個(gè)基因，開(kāi)始時(shí)微微上調（圖3A），6-12月時(shí)在整個(gè)大腦中急劇增加至一種穩定的狀態(tài)（圖3B）。18月齡App^NL-G-F小鼠的所有TDs在A(yíng)β沉積和PIG中間存在一個(gè)中等但顯著(zhù)的相關(guān)性（圖3C）,說(shuō)明PIG表達隨著(zhù)整個(gè)大腦中Aβ的沉積逐漸增加。

根據GO分析，作者得出該模塊參與了經(jīng)典補體級聯(lián)，以及補體級聯(lián)觸發(fā)的效應機制，如內吞作用，溶酶體降解、抗原處理和遞呈、免疫應答和氧化還原過(guò)程。

作者進(jìn)一步研究了PIG模塊的細胞學(xué)特征，鑒定出其與激活的小膠質(zhì)細胞（疾病相關(guān)DAM或者激活響應的ARM）和炎性星形膠質(zhì)細胞（A1）有關(guān)聯(lián)（圖S3D）。重點(diǎn)突出了5個(gè)與A1標記重疊的PIGs和15個(gè)DAM/ARM 基因（圖3D）。另外36個(gè)PIGs以前并沒(méi)有被定義為疾病相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)基因。激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞參與了前十的聯(lián)系*緊密的樞紐基因（圖3D,紅色）。作者評估這些PIGs是否可以在人數據庫中被鑒定出來(lái)。在41個(gè)細胞亞群中，與PIGs*相關(guān)的是AD相關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞（Mic1，圖S3E）。作者通過(guò)參與Aβ暴露和基因型的人Mic1??Marker基因的同源序列來(lái)放大基因表達變化（圖3E&F,橙&綠）。對小鼠的分析表明，人腦中的Mic1反應是對淀粉樣蛋白斑塊的大量的多細胞協(xié)調反應的一部分，而且這種反應會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的推移而演變。

圖S3 | GO分析和WGCNA共表達網(wǎng)絡(luò )分析

圖3?| Aβ斑塊誘導基因（PIGs）的鑒定

 

四、?使用原位測序在細胞分辨率下研究PIG模塊

ST展示了淀粉樣蛋白斑周?chē)亩嗉毎磻?，作者尋求一種正交獨立方法從單細胞分辨率下進(jìn)行驗證。原位測序（ISS）可以在一個(gè)反應中使用許多靶向特異的原位標簽。作者使用了特制的探針來(lái)繪制PIGs表達以及細胞類(lèi)型標簽（Itgam、 Cx3cr1、Csf1r對應小膠質(zhì)細胞;Slc1a3、Gfap 、Clu對應星形膠質(zhì)細胞; Syp對應神經(jīng)元; Plp1對應少突膠質(zhì)細胞；圖4A-C）。ISS實(shí)驗中，對App^NL-G-F和兩只18月齡WT小鼠各構建兩個(gè)文庫。用每個(gè)基因的熒光點(diǎn)數目來(lái)量化基因表達，并將熒光點(diǎn)聚類(lèi)到淀粉樣蛋白斑周位的5個(gè)同心圓上（圖4D）。51/54個(gè)PIGs在圈1上明顯富集，而C1qb在圈1上明顯減少（圖4E）。ISS的結果與ST的結果線(xiàn)相關(guān)性非常好（圖4E）。

作者開(kāi)發(fā)了一種算法來(lái)檢測PIG網(wǎng)絡(luò )的細胞特征，通過(guò)計算5μm半徑內的細胞類(lèi)型Marker斑點(diǎn)的富集來(lái)匹配每個(gè)斑點(diǎn)到細胞型。通過(guò)預測每個(gè)Marker基因的細胞類(lèi)型來(lái)驗證這個(gè)算法（圖4G）。很明顯，PIG響應Aβ，這主要是因為小膠質(zhì)細胞，小部分由于星形膠質(zhì)細胞（圖4H）。而一些PIGs在多種細胞類(lèi)型中明顯富集。例如，Cyba在小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中表達。

最后，作者使用RNA原位雜交，驗證18月齡App^NL-G-F的補體部分（C1qa、C4、 Clu)表達。實(shí)驗證實(shí)了C1qa在Itgam陽(yáng)性細胞（小膠質(zhì)細胞）中表達，Clu在?Slc1a3陽(yáng)性細胞（星形膠質(zhì)細胞）表達，C4在Mbp陽(yáng)性細胞（少突膠質(zhì)細胞）表達，這些細胞緊挨淀粉樣蛋白斑。這三個(gè)補體部分的細胞特征經(jīng)過(guò)RNA原位雜交檢測，與ISS分析結果一致。

 

圖4 | ISS鑒定的PIGs細胞標簽

 

五、?PIG模塊中小膠質(zhì)細胞基因和星形膠質(zhì)細胞基因的共表達

為了探究PIGs在不同細胞中表達的相關(guān)性在多大程度上是由累積的Aβ病理驅動(dòng)的，作者僅在PIGs上使用WGCNA分析，根據Aβ標簽分離所有ST的TDs為WT和四個(gè)AD分位數（圖5）。WGCNA生成了一個(gè)連接矩陣，表明每個(gè)基因的改變是如何與其他所有基因的關(guān)聯(lián)的。圖5展示了隨著(zhù)Aβ暴露，共表達網(wǎng)絡(luò )逐漸形成。

在WT中，所有PIGs的關(guān)聯(lián)相對較低，PIG被分為三個(gè)簇（圖5，綠、藍、橙）。ISS實(shí)驗（圖4H）證明了在綠色簇中，星形膠質(zhì)細胞基因（7/12）富集，而藍色（14/23）和橙色（14/28）簇聚集了小膠質(zhì)基因中表達的PIGs。在WT中，橙色的PIGs幾乎不關(guān)聯(lián)，而App^NL-G-F小鼠中，在接觸增長(cháng)的Aβ后，這些PIGs的基因被招募。隨著(zhù)Aβ指標增長(cháng)，PIGs內部和相互之間的關(guān)聯(lián)增強。在Q4-Q1中，隨蛋白斑積累程度增加，互作關(guān)系明顯增加。

 

圖5 | 隨Aβ沉積，PIGs逐漸共表達

 

六、?少突膠質(zhì)細胞模塊的不同區域反應

第二個(gè)變化比較大的模塊（紅色），在WGCNA(圖S3B)，由165個(gè)基因構成，他們主要在少突膠質(zhì)細胞中表達，因此命名為“OLIG模塊”。這個(gè)模塊最富集的功能種類(lèi)是GO:0007272包膜神經(jīng)元、GO:0043209髓鞘、GO:0008366軸突包膜以及GO:0042552髓鞘形成。模塊最富集的10個(gè)基因是髓鞘相關(guān)的轉錄本：Plp1、Mbp、Mobp、Cldn11、Mal、Apod、Cnp、Trf、Fth1、Plekhb1。比較OLIG與過(guò)往發(fā)表的小鼠單細胞數據，少突膠質(zhì)細胞關(guān)聯(lián)很強（圖S3C）,活化小膠質(zhì)細胞（DAM/ARM）輕度關(guān)聯(lián)（圖S3E）。OLIG與人AD相關(guān)的少突膠質(zhì)細胞Oli0關(guān)聯(lián)密切（圖S3E）。作者突出標記了20個(gè)人類(lèi)Oli0 markers同源序列（圖6A&B，橙色、綠色）。幾個(gè)Oli0同源序列與OLIG模塊同步上調和下調。

類(lèi)似于髓鞘類(lèi)（圖S3A）,與3月齡和18月齡的WT小鼠相比，App^NL-G-F小鼠在OLIG模塊的基因型軸線(xiàn)全腦范圍上全部上調（圖6A&6B）。這種基因型效應可能反映了小鼠大腦對人源和突變的App基因的整體反應。但是，從基因型中把Aβ暴露（Aβ軸）分理出后，作者發(fā)現了一個(gè)OLIG模塊的有趣變化：在3個(gè)月時(shí)，全部呈正相關(guān)，在18個(gè)月時(shí)為負相關(guān)（圖6A&6B）。在不同的大腦區域，這種反應也有明顯的差異（圖6C）。比較圖2C中淀粉樣蛋白斑和OLIG表達，可以明顯發(fā)現OLIG表達的主要驅動(dòng)因素不是Aβ指標而是大腦區域本身（圖6C）。在3月齡時(shí)，作者發(fā)現在纖維束（FB）、丘腦（TH）和下丘腦（HY）中顯著(zhù)的OLIG-Aβ正相關(guān)，而在內嗅皮層（ENTI）和幾個(gè)海馬體皮層中存在顯著(zhù)負相關(guān)。在18月齡時(shí)，作者在聽(tīng)覺(jué)區域（AUDS）發(fā)現了OLIG-Aβ存在明顯負相關(guān)，而在ENTI和海馬體中存在顯著(zhù)正相關(guān)。

作者進(jìn)而更詳細地從Aβ指標和OLIG表達的關(guān)系方面分析這些區域的不同。在圖2中，Aβ沉積隨疾病的進(jìn)展而不同。甚至在3個(gè)月時(shí)，有些TDs暴露于A(yíng)β（圖5，Q1中179個(gè)TDs）。隨著(zhù)Q4-Q2中TDs的Aβ緩慢增長(cháng)，OLIG表達增加（圖6D）。但是，三月齡有著(zhù)*高Aβ暴露（Q1，比Q4中Aβ高21倍）的TDs中OLIG的表達存在一種降低的趨勢。另外，低Aβ暴露的TDs中OLIG模塊的基因對的連接強度之和*強。為了進(jìn)一步證明發(fā)現，作者對三月齡App^NL-G-F小鼠的整個(gè)冠狀切片，設計四個(gè)OLIGs（Plp1、Mbp、Olig2和Cnp）探針做RNA原位雜交（圖6E&F）。結果顯示，在三月齡小鼠稠密的淀粉樣蛋白斑周?chē)?，這4個(gè)OLIGs明顯減少?？梢酝茰y，在輕度Aβ暴露下，OLIG模塊高表達和相互連接，但在高密度Aβ積累的微環(huán)境中表達減少。因此，部分OLIG模塊的區域差異與不同的Aβ暴露有關(guān)。

圖6 | 隨Aβ積累，OLIG模塊的時(shí)空響應

 

七、?人腦中PIG和OLIG模塊的可視化

作者使用3名AD患者和3名正常對照組死后的人腦樣本進(jìn)行實(shí)驗。AD大腦處于淀粉蛋白斑C階段和神經(jīng)元糾纏V-VI階段的疾病進(jìn)展期。研究描繪了與AD相關(guān)的額上回組織譜，總共報告了222個(gè)基因表達譜，包括45個(gè)人PIGs同源序列，OLIG模塊中42個(gè)斑塊反應基因的同源序列，以及一系列細胞類(lèi)型Marker。這些細胞Marker很好地在細胞分辨率下描繪了大腦區域（圖7A）。PIG模塊（圖7B,紫色）和OLIG模塊（圖7C,紅色）基因如預期的在大腦灰質(zhì)和白質(zhì)中富集。

作者使用分析小鼠ISS數據的方法來(lái)研究對照組中人PIGs和AD大腦同源序列的分布。大部分PIGs在A(yíng)D和對照組中相同的細胞類(lèi)型中表達。在對照組中，PIG模塊中3個(gè)子模通過(guò)星形膠質(zhì)細胞（綠色簇）和小膠質(zhì)細胞(藍色和橙色簇)表達（圖7D）。然而，作者依然在神經(jīng)元中發(fā)現了9個(gè)富集的PIGs(LGMN、HEXB、HEXA、CTSB、CTSA、GNS、GPX4、CTSD和ITM2B)，兩個(gè)在少突膠質(zhì)細胞中富集（LGALS3BP和CD9）。PLEK、CYBA和LAPTM5在小鼠的少突膠質(zhì)細胞中顯著(zhù)富集，而在人類(lèi)的小膠質(zhì)細胞中顯著(zhù)富集。作者最終確定18/45的個(gè)PIGs在淀粉斑細胞位上明顯富集，包括9個(gè)小膠質(zhì)細胞PIGs，5個(gè)星形膠質(zhì)細胞PIGs以及5個(gè)多細胞類(lèi)型表達的PIGs。有趣的是，作者發(fā)現APOE和ARPC1B在小膠質(zhì)細胞中顯著(zhù)表達，NPC2、 S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR在A(yíng)D患者星形膠質(zhì)細胞中顯著(zhù)表達，而在對照組中沒(méi)有，提示在A(yíng)D患者中疾病相關(guān)的膠質(zhì)細胞激活。

作者使用類(lèi)似的方法，從OLIG模塊中差異表達*高的基因選出42個(gè)人類(lèi)同源序列的細胞進(jìn)行細胞特征分析（圖7E）。淀粉樣斑塊細胞生態(tài)位中有22個(gè)基因顯著(zhù)缺失，5個(gè)基因在淀粉樣斑塊細胞生態(tài)位中顯著(zhù)增高表達。有趣的是,通常由少突膠質(zhì)細胞表達的APOD在大腦中表達，并在A(yíng)D中上調，在A(yíng)D患者的小膠質(zhì)細胞中也顯著(zhù)富集，但在對照組中沒(méi)有。

對比人和小鼠的數據，需要顧及物種差異，在鼠中，只有淀粉樣斑塊誘導的病理進(jìn)行了研究，然而，AD的后期階段，Tau蛋白、壞死性凋亡等等對病理的額外貢獻導致病理情況變得復雜，并沒(méi)有出現在小鼠模型中。小鼠模型反映了疾病的早期階段，而人從淀粉斑出現到最終發(fā)展為癡呆需要長(cháng)達20年的時(shí)間。人類(lèi)疾病發(fā)生的過(guò)程會(huì )更加復雜，不過(guò)小鼠中鑒定出的PIG和OLIG模塊會(huì )在A(yíng)D晚期有重要作用。

圖7 | 通過(guò)ISS使人腦中PIG和OLIG模塊可視化

 

文章總結

本文使用空間轉錄組在數百個(gè)微小組織區域（TDs）進(jìn)行原位測序，發(fā)現了淀粉樣蛋白斑誘導的全基因組轉錄組改變。同時(shí)使用正交的原位測序方法在單細胞水平分析了數百個(gè)重要基因。進(jìn)而繪制了響應Aβ沉積的兩個(gè)基因共表達網(wǎng)絡(luò )—-PIGs和OLIG。分析數據發(fā)現淀粉樣蛋白斑并不是簡(jiǎn)單的“發(fā)病結果”，還會(huì )誘導一系列的基因變化 ，影響疾病進(jìn)展。