高分轉錄組研究思路|2020年百邁客醫學(xué)高分案例集錦-上

今年疫情突發(fā)，不知不覺(jué)已經(jīng)和疫情抗戰了大半年，九月倏然而至。北京的夏天真是酷熱，前不久去陰雨綿綿的昆明，竟嗅到清甜的“三秋桂子”，心中不禁驚詫?zhuān)涸乔锏搅恕?/p>

秋天本是豐收的季節，百邁客醫學(xué)今秋有何收獲呢？嗯，言歸正傳，接下來(lái)我們要講一講今年，2020年，百邁客醫學(xué)的文章碩果。我們看一看課題如何設計，怎么利用測序技術(shù)發(fā)文章。下面整理了部分5分以上的百邁客醫學(xué)合作文章研究思路簡(jiǎn)介。

 

案例一：轉錄組多組學(xué)解析揭示Tfr1基因對米色脂肪組織的產(chǎn)熱能力以及分化的影響

在寒冷刺激下或者β腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理后，WAT白色脂肪組織中會(huì )出現散在的棕色樣脂肪細胞，稱(chēng)為“棕色/米色脂肪”組織Brown/Beige adipose tissue，屬于產(chǎn)熱脂肪。鐵穩態(tài)對于維持多種細胞類(lèi)型的細胞功能至關(guān)重要。但是，鐵是否會(huì )影響脂肪細胞的產(chǎn)熱特性目前尚不清楚。

研究思路：本文首先從3個(gè)組學(xué)：β腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316,243處理的米色脂肪細胞活躍啟動(dòng)子標記H3K9/14Ac Chip-seq 以及生理鹽水對照組同時(shí)進(jìn)行RNA-seq、iTRAQ蛋白組測序，多組學(xué)整合分析鑒定調控米色脂肪細胞發(fā)育的關(guān)鍵候選基因Tfr1。再通過(guò)構建候選基因敲除小鼠模型，從表型、組織、基因表達（RNA-seq）、蛋白表達到機制，層層遞進(jìn)，逐步由淺到深解析。最終發(fā)現Tfr1通過(guò)鐵依賴(lài)性和非鐵依賴(lài)性機制在產(chǎn)熱脂肪細胞中起重要作用。

 

 

案例二：成纖維細胞重編程為自組織的感覺(jué)神經(jīng)節類(lèi)器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節細胞

文章題目:Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts

雜志&IF:Sci Adv,IF=13.116

合作單位：中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室&武漢大學(xué)人民醫院眼科中心

鑒于類(lèi)器官的優(yōu)勢，在研究發(fā)育機制以及對相關(guān)疾病進(jìn)行建模和治療方面，作者試圖使用可控制體內感覺(jué)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節發(fā)育的轉錄因子TF，將小鼠和人成纖維細胞重編程為神經(jīng)節類(lèi)器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節細胞RGC。SG體感神經(jīng)節和RGC之間廣泛的分子同源性，區分這2種類(lèi)型的神經(jīng)元是一個(gè)難題，需要篩選RGC特異性標記，需要篩選誘導成纖維細胞自組織和網(wǎng)絡(luò )化的iSG(induced SG)和iRGC(induced RGCs)的最有效方法。

研究思路：通過(guò)對多個(gè)SG和RGC 轉錄因子TF的篩選，作者確定了三個(gè)TF組合ABI是重編程小鼠和人類(lèi)成纖維細胞為自組織和網(wǎng)絡(luò )化iSG類(lèi)器官的最有效組合。通過(guò)免疫染色、qRT-PCR、全細胞膜片鉗記錄、鈣成像以及混合bulk轉錄組和單細胞轉錄組scRNA-seq方法，能夠證明iSG類(lèi)器官具有分子和細胞特征、亞型多樣性、電生理特性和周?chē)窠?jīng)支配能力和周?chē)鶶G的特征模式。此外，使用免疫標記和scRNA-seq分析，鑒定出了真正的RGC特異性分子標記，以證明ABI組合具有從成纖維細胞誘導少量iRGC的額外能力。不同于iSG神經(jīng)元，iRGC保持類(lèi)似于視網(wǎng)膜中內源性RGC的分散分布模式。

 

 

案例三：間充質(zhì)干細胞和各種眼細胞之間通過(guò)線(xiàn)粒體的細胞間轉運實(shí)現生物能crosstalk

文章題目:Bioenergetic Crosstalk between Mesenchymal Stem Cells and various Ocular Cells through the intercellular trafficking of Mitochondria

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：溫州醫學(xué)院附屬眼視光醫院視網(wǎng)膜再生醫療研究組&首都醫科大學(xué)附屬北京同仁醫院北京市眼科研究所

線(xiàn)粒體疾病會(huì )優(yōu)先影響人眼中能量需求較高的組織，例如視網(wǎng)膜和角膜內皮?；陂g充質(zhì)干細胞（MSC）的治療已被證明對眼部變性有益。但是，除了神經(jīng)保護性旁分泌作用外，MSC對視網(wǎng)膜和角膜組織有益作用的潛在機制在很大程度上尚不清楚。這項研究中試圖探究從MSC到眼細胞間轉移的線(xiàn)粒體的命運和相關(guān)特征。

研究思路：將MSC與角膜內皮細胞（CEC）、661W細胞（感光細胞系）和ARPE-19細胞（視網(wǎng)膜色素上皮細胞系）共培養。免疫熒光實(shí)驗、熒光激活細胞分選和共聚焦顯微鏡成像探究細胞間轉移的線(xiàn)粒體的特性和命運。測量受體細胞的耗氧率以研究細胞間線(xiàn)粒體轉移的影響。進(jìn)行轉錄組分析以研究具有轉移線(xiàn)粒體的受體細胞中代謝基因的表達。結果：線(xiàn)粒體轉運/“捐贈”是MSC與各種眼細胞（包括角膜內皮，視網(wǎng)膜色素上皮和感光細胞）之間普遍存在的細胞間機制。此外，轉運過(guò)程取決于基于F-肌動(dòng)蛋白隧道納米管。接受MSC線(xiàn)粒體的魚(yú)藤酮預處理細胞顯示出增加的有氧能力和線(xiàn)粒體基因的上調?；铙w成像技術(shù)確定了轉移的線(xiàn)粒體的最終命運：通過(guò)溶酶體降解或通過(guò)胞吐作用形成細胞外囊泡。結論：首次確定了線(xiàn)粒體通過(guò)基于F-肌動(dòng)蛋白隧道納米管從MSCs向各種眼細胞進(jìn)行細胞間轉移的特征和命運，有助于表征基于MSC的眼組織再生治療方法。

案例四：長(cháng)期培養過(guò)程中維生素C通過(guò)抑制Notch3延緩牙周膜干細胞衰老

牙周膜干細胞（PDLSCs）作為牙周組織修復和再生的潛在“種子細胞”，需要在體外進(jìn)行大規模擴增。長(cháng)期培養過(guò)程中發(fā)生的PDLSC衰老可能會(huì )損害PDLSC的治療效果。培養基補充劑可用于抗衰老。然而，長(cháng)期培養過(guò)程中維生素C（Vc）處理對PDLSCs的作用和機制仍不清楚。

研究思路：在長(cháng)期培養過(guò)程中，經(jīng)Vc處理的PDLSCs細胞保持細長(cháng)的形態(tài)，較高的生長(cháng)速率和遷移能力，干性和成骨分化能力。此外，低傳代次數EP vs 高傳代次數LP vs LP+Vc處理轉錄組測序發(fā)現，Notch3在細胞衰老過(guò)程中顯著(zhù)上調，Vc處理通過(guò)抑制長(cháng)期培養過(guò)程中的Notch3延緩了PDLSCs的衰老?？傊?，Vc處理通過(guò)減少Notch3的表達來(lái)抑制PDLSCs的衰老，這可能是一種在細胞長(cháng)期培養過(guò)程中抑制細胞衰老的簡(jiǎn)單而有用的策略。

 

 

案例五:慢性酒精攝入和HBV通過(guò)HBx-SWELL1- 花生四烯酸信號傳導誘導脂質(zhì)代謝異常并激活HBV-Tg小鼠Treg細胞

文章題目:Chronic ethanol consumption and HBV induce abnormal lipid metabolism through HBx/SWELL1/arachidonic acid signaling and activate Tregs in HBV-Tg mice

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究所腫瘤研究室

慢性酒精攝入已成為世界范圍內的公共衛生問(wèn)題，它在感染了乙肝病毒（HBV）的患者中促進(jìn)了慢性肝病的發(fā)展?；ㄉ南┧岽x物前列腺素E2（PGE2）可激活調節性T細胞（Tregs）的功能。本研究旨在發(fā)現慢性乙醇酒精攝入導致HBV誘導的異常脂質(zhì)代謝增強和Tregs激活的潛在機制。

研究思路：通過(guò)ELISA實(shí)驗測定體內和體外花生四烯酸代謝物PGE2和LTD4含量。通過(guò)TCGA公共數據分析篩選到與肝癌預后和診斷相關(guān)的SWELL1基因。使用siRNA減弱HepG2、HepG2.2.15肝癌細胞系和K180食管癌細胞系中SWELL1的表達，然后對HepG2細胞進(jìn)行轉錄組測序。Western blot分析和RT-qPCR用于檢查臨床HCC樣本和細胞系中的HBx（乙型肝炎病毒X基因）、SWELL1和轉錄因子Sp1表達。通過(guò)流式細胞術(shù)在HBV-Tg小鼠（HBV全基因組轉基因小鼠模型）中測試了慢性酒精攝入對Tregs的影響，收集酒精攝入組和對照組脾臟Tregs細胞進(jìn)行轉錄組測序分析。結果：體內和體外觀(guān)察到乙醇/酒精和乙肝病毒在脂質(zhì)代謝異常中的協(xié)同作用，SWELL1（或HBx）的降低導致脂質(zhì)含量和花生四烯酸代謝產(chǎn)物減少，乙醇和SWELL1可升高小鼠和細胞系肝臟中PGE2或LTD4的水平。乙醇通過(guò)激活HBx/Sp1/SWELL1/花生四烯酸信號傳導調節了脂質(zhì)代謝異常。慢性酒精攝入顯著(zhù)增加了HBV-Tg小鼠的PBL(外周血淋巴細胞) Tregs和脾臟Tregs的數量，這與體內和體外PD-L1表達的增加一致。RNA-seq數據顯示，在以乙醇攝入小鼠或HBV-Tg小鼠的Tregs細胞中多個(gè)基因轉錄水平發(fā)生了改變。結論：長(cháng)期攝入乙醇可通過(guò)HBx/SWELL1/花生四烯酸信號增強HBV誘導的異常脂質(zhì)代謝，并激活小鼠的Tregs功能。