自1977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法測序技術(shù)以來(lái)，新的測序技術(shù)、測序平臺不斷涌現。目前，三代測序技術(shù)已憑借其技術(shù)優(yōu)勢受到越來(lái)越多科研工作者的青睞。三代測序技術(shù)集長(cháng)讀長(cháng)和高通量于一身，對高純度、長(cháng)讀長(cháng)核酸分子進(jìn)行實(shí)時(shí)測序，此技術(shù)已廣泛應用于科學(xué)研究及精準醫療中。三代測序的代表為Oxford Nanopore Technologies（ONT）和PicBio（PB）這兩大測序平臺，下面就這兩個(gè)平臺與大家說(shuō)道說(shuō)道：
測序原理
ONT測序將人工合成的一種多聚合物的膜浸在離子溶液中，多聚合物膜上布滿(mǎn)了經(jīng)改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白（納米孔），也就是Reader蛋白，在膜兩側施加不同的電壓產(chǎn)生電壓差，DNA鏈在馬達蛋白的牽引下，解螺旋通過(guò)納米孔蛋白，不同的堿基會(huì )形成特征性離子電流變化信號，通過(guò)對這些信號的檢測，得到堿基序列，完成測序。
PB的測序空間為ZMW（zero-mode wave guides，零模波導孔），外徑100多納米，DNA分子掉入孔中，不同熒光標記的脫氧核苷酸在聚合酶的作用下，會(huì )產(chǎn)生不同的熒光信號，隨后標記基團自動(dòng)脫落，維持了信號的持續監測。激光從ZMW底部打入，由于孔直徑很小而不能穿過(guò)孔進(jìn)入上方溶液區，從而把背景噪音降到最低。
由此，ONT的納米孔是指膜上的納米孔通道蛋白，PB的納米孔為ZMW孔，在“方寸之地”完成測序。
PB測序
ONT測序
測序儀器
ONT平臺：MinION、GridION X5、PromethION；具體區別如下：
PB平臺：RSII和Sequel系列儀器，目前Sequel系列平臺測序通量高、單Gb數據成本低、周期短的特點(diǎn)已將RSII平臺取代。
2平臺發(fā)展前景！
ONT平臺在軟、硬件及建庫技術(shù)等各方面不斷升級優(yōu)化，如推出的R10測序芯片，將單堿基電流信號判讀率提升到2次，數據質(zhì)量方面將會(huì )有了明顯改善，由于小編未有足夠的實(shí)測數據，目前就不做分享了。
目前PacBio推出Sequel II測序平臺，其單張芯片測序通量較Sequel平臺提升了8倍左右。
建庫方式
ONT平臺：在DNA測序方面，利用片段篩選，非片段篩選和片段打斷3種方式對DNA樣品進(jìn)行1D建庫。
片篩即利用Bluepippin對DNA樣品進(jìn)行片段篩選，并依據科研人員的實(shí)際研究需求梯度富集回收大片段用于建庫測序。非片段篩選即DNA提取后，未經(jīng)過(guò)片段篩選的過(guò)程，直接進(jìn)行建庫測序。片段打斷即利用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或其它大小的片段，這種技術(shù)在一定程度上可提升單cell產(chǎn)量，其可應用于個(gè)體重測序、甲基化等研究。倘若您想組裝基因組，小編還是建議使用片段篩選的方式，富集大片段進(jìn)行建庫測序，經(jīng)過(guò)片段篩選后，會(huì )有更大比例的長(cháng)片段DNA分子穿過(guò)納米孔，這樣得到的測序讀長(cháng)數據相較于其它建庫方式會(huì )普遍變長(cháng)。
PB平臺：在DNA測序方面，PB一般使用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或30kb的文庫，對打斷的DNA樣品進(jìn)行末端修復，連接啞鈴型的接頭，使用Bluepippin進(jìn)行片段篩選，獲得測序文庫。
以ONT的片篩文庫和PB的文庫比較，由于PB經(jīng)過(guò)了片段打斷，且受DNA聚合酶活性的影響，在讀長(cháng)方面稍遜色于ONT平臺。以下就對它倆的測序數據做一比較。
測序數據
數據讀長(cháng)比較，后3列依次是Read_N50，平均長(cháng)度和最長(cháng)reads大小，單位都是bp哦。。。。
以某物種為例，我們看看各片段的分布：
總結：從這份數據可以看出，PB 平臺18K以上的數據占39.6%，Nanopore平臺20K以上的數據可達68%。
數據糾錯
ONT平臺和PB平臺下機數據的準確率一般85%左右，后期Canu軟件進(jìn)行Reads糾錯，應用Reads間去比對最長(cháng)的Reads(一般后期應用30-50×的數據用于基因組組裝)，數據的準確率有了大幅度提升。ONT平臺應用smart、Canu、wtbdg等 3款軟件進(jìn)行組裝，racon兩輪糾錯（三代數據），pilon三輪糾錯（2代數據）后，可將基因組的準確率提升至99.99%。PB平臺一般應用smart、Canu、wtbdg、Falcon 4款軟件進(jìn)行組裝，arrow糾錯（三代數據），pilon三輪糾錯（2代數據）后，可將基因組的準確率提升至99.999%。
總述
PB、ONT各有千秋，各具特色。目前百邁客已完成三代測序平臺的完整搭建，并集提取、建庫、測序于一體，可滿(mǎn)足科研工作者的不同測序需求；
京公網(wǎng)安備 11011302003368號