前沿|nanopore全長(cháng)測序新方法nano-ID檢測新合成的isoform及其穩定性

本文為大家分享一個(gè)基于nanopore平臺檢測新合成isoform及其穩定性的技術(shù)。

真核基因通常產(chǎn)生多種RNA isoform，其可產(chǎn)生功能上不同的蛋白質(zhì)變體。然而，RNA isoform的合成和穩定性鮮少了解。原因是目前量化RNA代謝的方法是不能檢測RNA isoform的“短讀長(cháng)”測序。

因此作者開(kāi)發(fā)了nano-ID（nanopore sequencing-based Isoform Dynamics ），其結合了代謝RNA標記、天然RNA分子的“長(cháng)讀長(cháng)”納米孔測序和機器學(xué)習。

一個(gè)主要挑戰是尋找合適的核苷類(lèi)似物用于RNA標記和檢測標記的RNA isoform，已知標記效率限制在約2-3％，即100個(gè)天然核苷酸中只有2個(gè)或3個(gè)被核苷酸類(lèi)似物取代。作者利用ERCC標準品，分別以添加核苷酸類(lèi)似物和不添加的天然堿基作體外轉錄，將體外轉錄產(chǎn)物進(jìn)行nanopore direct RNA測序，比較了幾種不同的核苷酸類(lèi)似物：5EU(5-Ethynyluridine，5-乙炔基尿苷)、5BrU(5-bromouridine，5-溴尿苷)、5IU(5-iodouridine，5-碘尿苷)、4sU(4-thiouridine，4-硫代尿苷)和?6sG(6-thioguanine，6-硫鳥(niǎo)嘌呤)。最終結果表明：5EU和5IU標記檢出率比較高，且5EU對細胞無(wú)毒性。且5EU標記的新合成RNA中約有一半U可以被識別為5EU，且從原始電信號中可以明顯區分5EU和天然U堿基。選用5EU進(jìn)行體內實(shí)驗。

整體的nano-ID方法如下，作者在人慢性髓系白血病細胞系K562中進(jìn)行了體內研究：5EU處理60min組、5EU處理24h組和未處理組。同時(shí)，作者進(jìn)行了polyA長(cháng)度分析。

熱休克反應（42°C 60min）處理，許多RNA isoform改變了合成速率、穩定性和剪接模式。nano-ID分析結果表明，對于某一個(gè)基因座對應的組合RNA混合物（基因水平）的代謝變化與單一轉錄本代謝變化差異非常大。雖然組合的RNA穩定性與poly（A）尾巴長(cháng)度相關(guān)，但是單個(gè)RNA isoform可以顯著(zhù)偏離。nano-ID能夠在不同細胞狀態(tài)和條件下研究單個(gè)RNA分子和isoform水平的RNA代謝。

 

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