淺談基因測序

1869年，Friedrich Miescher 發(fā)現和分離出脫氧核糖核苷酸，人類(lèi)對生命的研究開(kāi)始向分子方向啟程，自1977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法一代測序技術(shù)開(kāi)始，涌現出GS FLX，Solexa，SOLID，PicBio，Oxford Nanopore Technologies（ONT）多種測序平臺，測序技術(shù)發(fā)展至今已有四十多年時(shí)間，而每次新興平臺的出現，無(wú)不顯現出生物領(lǐng)域人類(lèi)文明的又一次大的向前邁步，是人類(lèi)科技奮斗史中的里程碑。而也正是一代代測序技術(shù)的發(fā)展和我們一代代科學(xué)家不斷努力，測序技術(shù)被不斷應用于基因組組裝，功能基因定位，進(jìn)化分析，育種以及精準醫療等領(lǐng)域，為人類(lèi)的生活帶來(lái)一次次便利的同時(shí)也帶來(lái)了無(wú)限可能。

第一代測序技術(shù)應用了Sanger雙脫氧鏈終止法，它的讀長(cháng)可達1000bp，準確率高達99.999%，但測序前需要對特定區段進(jìn)行引物設計且通量低，很難應用于組學(xué)方面的研究?；诖颂攸c(diǎn)，涌現出二代測序技術(shù)，它主要的特點(diǎn)為短讀長(cháng)，高通量。以Illumina?Solexa為例，它采用邊測序邊合成的方法，首先利用超聲波將DNA打斷成200-500bp小片段文庫，加接頭后DNA片段隨機附著(zhù)于flowcell表面，經(jīng)過(guò)橋式PCR擴增形成“DNA簇”，實(shí)現堿基信號強度放大，采用邊合成邊測序的方法，進(jìn)行全基因組全面，準確的測序。

 

圖1? NovaSeq 6000

百邁客目前主要應用2017年Illumina平臺推出的NovaSeq系列測序平臺，雖然較于以往二代平臺，它的測序質(zhì)量值、Index的測序識別、DNA文庫冗余度等指標有了明顯提升，但無(wú)法克服短讀長(cháng)的reads 在基因組組裝、大片段變異檢測、轉錄組、甲基化等研究中的短板?；诖饲闆r，三代測序應運而生。

目前，三代測序的主要代表為PicBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）這兩大測序平臺，以ONT平臺為例，它主要通過(guò)電信號識別堿基序列，單鏈DNA/RNA通過(guò)納米孔（蛋白通道），不同的堿基會(huì )形成特征性離子電流變化信號，通過(guò)對這些信號的檢測，得到堿基序列，完成測序。與二代相比，它主要的優(yōu)勢在于在測序前，不會(huì )將DNA樣品打斷成小片段，而是對我們提取DNA進(jìn)行片段篩選，一般篩選10-100kb大小的片段進(jìn)行測序，這就對我們前期提取的DNA質(zhì)量要求較高。

三代測序技術(shù)的出現，為復雜的多倍體基因組組裝帶來(lái)了福音。這種基因組由于倍性多，重復序列高，而二代測序局限于產(chǎn)生單倍體間的共有序列，導致此類(lèi)物種的研究停滯不前。而ONT平臺由于其長(cháng)讀長(cháng)，跨越完整的重復區域，大的結構變異也得到了很好的檢測。eg. 納米孔測序技術(shù)可以將T-DNA結構的分辨率提升到36Kb。這就意味著(zhù)，在這類(lèi)突變體功能基因定位時(shí)，可以直接通過(guò)測序的方式，找到材料中T-DNA的插入位置及拷貝數，從而找到功能基因，實(shí)現基因克隆。和傳統的圖位克隆比較，將大大縮短定位周期。傳統的自然突變材料，如果已經(jīng)有定位區段，應用二代檢測SNP，ONT檢測SV的方式可以讓我們的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因組組裝方面，以生菜基因組為例，短讀長(cháng)的二代測序組裝出21116個(gè)contig和2.21G的基因組，基于ONT平臺，則產(chǎn)生了1169個(gè)contig，contig N50為7.3Mb。二代數據產(chǎn)生了想較于三代數據18倍的contig用于基因組組裝，而三代平臺讀長(cháng)的優(yōu)勢為高質(zhì)量的基因組組裝提供了便利。在轉錄組研究方面，ONT平臺的長(cháng)讀長(cháng)可以為我們帶來(lái)完整的轉錄異構體的序列，且可做定量研究，這將避免二代短片段數據在轉錄本組裝上的錯誤，更好的應用于轉錄組研究。

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