利用第三代納米孔長(cháng)讀段測序技術(shù)構建和注釋蜜蜂球囊菌的全長(cháng)轉錄組

文章名稱(chēng)：Construction and Annotation of Ascosphaera apis Full-Length Transcriptome Utilizing Nanopore Third-Generation Long-Read Sequencing Technology

發(fā)表期刊：中國農業(yè)科學(xué)

發(fā)表時(shí)間：2020年11月

影響因子：2.302

研究背景

蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis，簡(jiǎn)稱(chēng)球囊菌）是專(zhuān)性侵染蜜蜂幼蟲(chóng)的致死性真菌病原，引發(fā)的白堊病是長(cháng)期危害養蜂生產(chǎn)的頑疾，不僅可導致蜜蜂幼蟲(chóng)的大量死亡，還能導致成年蜜蜂數量的銳減以及蜂群群勢和蜂產(chǎn)品產(chǎn)量的驟降。目前，球囊菌的基因組注釋信息尚不完善，高質(zhì)量參考轉錄組匱乏，嚴重限制了球囊菌的組學(xué)和分子生物學(xué)研究。

材料和方法

球囊菌菌株由福建農林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護實(shí)驗室分離、純化和保存。純化得到的純凈菌絲樣品和孢子樣品經(jīng)液氮速凍后迅速轉移到-80℃超低溫冰箱保存備用。利用納米孔長(cháng)讀段測序技術(shù)對球囊菌的純化菌絲（Aam）和純化孢子（Aas）分別進(jìn)行測序，將高質(zhì)量的三代測序數據混合后用于構建全長(cháng)轉錄組，并通過(guò)比對主流數據庫進(jìn)行功能注釋?zhuān)瑫r(shí)對球囊菌的長(cháng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行鑒定和分析。

結果

1、納米孔測序數據質(zhì)控

球囊菌菌絲和孢子的納米孔測序分別得到6321704和6259727條原始讀段，N50分別達到1094和1157bp，平均長(cháng)度分別為992和1047bp，長(cháng)的長(cháng)度分別為9421和13060bp（表1）。來(lái)源于A(yíng)am和Aas的原始讀段的長(cháng)度分布介于1-10kb以上，其中分布reads數多的長(cháng)度均為1kb（圖1-A、1-B）；原始讀段的Q值分布介于Q6-Q15，分布reads數多的質(zhì)量值分別為Q9和Q11（圖1-C、1-D）。

2、全長(cháng)轉錄本的鑒定和分析

進(jìn)一步過(guò)濾冗余全長(cháng)有效讀段，分別得到9859和16795條非冗余全長(cháng)轉錄本，N50分別達到1482和1658bp，平均長(cháng)度分別達到1187和1303bp，長(cháng)的長(cháng)度分別為6472和6815bp（表2）；上述非冗余全長(cháng)轉錄本的長(cháng)度介于1-7kb，其中分布在1kb的全長(cháng)轉錄本數多。進(jìn)一步對Aam和Aas的非冗余全長(cháng)轉錄本進(jìn)行Venn分析，結果顯示有6512個(gè)非冗余全長(cháng)轉錄本為菌絲和孢子所共有，分別有3347和10283個(gè)非冗余全長(cháng)轉錄本為二者特有（圖2-A）。

3、全長(cháng)轉錄本的數據庫注釋

在球囊菌菌絲和孢子中共鑒定出20142條全長(cháng)轉錄本，數據庫注釋結果顯示，分別有20809、11151、17723、12164、11340和9833全長(cháng)轉錄本可注釋到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG數據庫。注釋全長(cháng)轉錄本數量多的物種是球囊菌、Polytolypahystricis和莢膜組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatum）（圖2-B）

4、lncRNA的鑒定及分析

利用CPC、CPAT、CNCI和Pfam4種方法依次鑒定出1906、1682、750和648條lncRNA，四者的交集為648個(gè)（圖3-A）；其中基因間區lncRNA（longintergenicRNA，lincRNA）、反義鏈lncRNA（anti-senselncRNA）和正義鏈lncRNA（senselncRNA）的數量分別為480、119和49個(gè)（圖3-B）。

總結

構建和注釋了球囊菌的高質(zhì)量全長(cháng)轉錄組，為探究球囊菌轉錄組的復雜性、完善參考基因組的序列和功能注釋信息以及深入開(kāi)展球囊菌可變剪接體的功能研究提供了關(guān)鍵依據。

深度挖掘數據和拓展

同期作者利用納米孔全長(cháng)轉錄組測序數據對蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）和另一蜜蜂真菌病原東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosemaceranae）的現有參考基因組在結構功能注釋上進(jìn)行了較好的完善，同時(shí)也對基因的可變剪接（alternativesplicing，AS）和可變多聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA）進(jìn)行解析。通過(guò)gffcompare軟件將全長(cháng)轉錄本與參考基因組注釋的轉錄本進(jìn)行比較，對基因組注釋基因的非編碼區向上游或下游延伸，修正基因的邊界。利用MISA軟件鑒定長(cháng)度在500bp以上的全長(cháng)轉錄本的簡(jiǎn)單重復序列（simplesequencerepeat，SSR）位點(diǎn)信息。使用Blast工具將鑒定到的新基因和新轉錄本比對Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG數據庫，從而獲得功能注釋。通過(guò)Astalavista軟件鑒定基因的AS事件類(lèi)型，統計分析可變剪切的結果。采用TAPISpipeline對基因的APA位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，得到APA的位點(diǎn)信息。分別利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam4種方法對長(cháng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行預測，取四者的交集作為高可信度的lncRNA。研究結果較好地優(yōu)化了現有的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和蜜蜂球囊菌參考基因組已注釋基因的結構和功能注釋信息，并補充和注釋了大量參考基因組未注釋的新基因和新轉錄本，同時(shí)也為其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鑒。