眾所周知，ATAC-seq作為可以獲得全基因組染色質(zhì)可及性圖譜、轉錄調控因子作用機制的高通量技術(shù)，是從表觀(guān)水平上研究疾病發(fā)生發(fā)展中轉錄水平調控機制的利器，那具體如何借助這一利器發(fā)現疾病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵轉錄因子，并揭示其調控機制呢？今天我們就通過(guò)這篇NC文獻get其中的經(jīng)典套路。
研究背景
膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，由于不可避免地會(huì )出現浸潤細胞超出切除范圍，所以預后仍不理想。此外，腫瘤邊緣區的膠質(zhì)瘤細胞的化療效果較差，并與腫瘤復發(fā)有關(guān)?？紤]到浸潤邊緣腫瘤細胞相比于中心區細胞具有獨特的微環(huán)境和轉錄特征，這兩種細胞群可能受不同的分子通路調控。
表觀(guān)遺傳學(xué)對于正常干細胞發(fā)育和分化過(guò)程中的可塑性、維持異常癌癥干細胞狀態(tài)至關(guān)重要。在GBM中，染色質(zhì)重構支持膠質(zhì)瘤干細胞(GSC)發(fā)育過(guò)程的重現，促進(jìn)腫瘤生長(cháng)。研究已發(fā)現了在培養的GSC或患者來(lái)源的異種移植老鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中與遷移和浸潤相關(guān)的轉錄因子（TF），如ZEB1、STAT324等。然而，由于浸潤性腫瘤細胞在其微環(huán)境中對運動(dòng)性、黏附性、缺氧、代謝和免疫反應的復雜適應，這些TF在多大程度上調節腫瘤細胞遷移一直較難分辨。對直接從腫瘤灶分離的人類(lèi)GSC群的TF進(jìn)行分析，可以發(fā)現在培養細胞和混合正常腦實(shí)質(zhì)的中沒(méi)有的調控遷移的內在調節因子。
在此，作者從人GBM和生發(fā)層(GM)組織中直接分離出GSC和神經(jīng)干細胞/祖細胞(NSPC)，基于A(yíng)TAC-seq研究在相似的發(fā)育背景下腫瘤發(fā)生的內在轉錄調控因子及其調控機制。
研究方法
- ATAC-seq
通過(guò)熒光激活細胞分選術(shù)（FACS）從GM和GBM組織中分離的細胞GSC（EGF+/-）、NSPC（EGF+/-），分別進(jìn)行ATAC-seq。
- 功能驗證實(shí)驗
CRISPR-Cas9基因敲除與過(guò)表達（TEAD1、TEAD4、EGFR等）；RNA-seq；體外–細胞增殖與遷移實(shí)驗；體內–異種移植實(shí)驗；染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗等。
研究結果
1、GSC的全基因組染色質(zhì)可及性特征
E – GBM在體外缺乏干細胞特性，在體內缺乏腫瘤發(fā)生機制，為了明確評估GSC中染色質(zhì)可及性在發(fā)育方面的作用，將E+GSC和E+NSPC干細胞中富集peak與E- GBM相比較，發(fā)現了5020個(gè)差異peak，這些peak關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行功能注釋與富集分析表明這些基因與干細胞維持和增殖的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。作者對E+GSC與所有其他細胞群(NSPC與E-GBM)進(jìn)行了差異可及性分析，以鑒定腫瘤干細胞表型特有的調控因子，發(fā)現了在腫瘤GSC中特異性富集的10509個(gè)peak，對應4015個(gè)蛋白編碼基因，它們與細胞遷移、運動(dòng)和ECM過(guò)程具有顯著(zhù)的相關(guān)性。在比較E+GSC和NSPC轉錄組時(shí)也發(fā)現了類(lèi)似的功能基因集關(guān)聯(lián)。
2、基于A(yíng)TAC-seq鑒定GSC中的關(guān)鍵轉錄因子
通過(guò)ATAC-seq分析染色質(zhì)的可及性，不僅可以識別轉錄的調控區域，還可以推斷出其中的TF活性。在此，作者鑒定了27個(gè)GSC腫瘤特異性的TF motif，26個(gè)在E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF motif。其中，TEAD1/4是具有很高活性的TF（ motif是GSC特有peak中顯著(zhù)富集，且基因表達水平高），其它候選TF包括ATF3、RFX1、FOXA1等。而E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF包括SOX1、IRF3、NFIA等。然后,作者利用以前的類(lèi)似的E+/E-GBM的RNA-seq數據，考慮到腫瘤特異性TF的基因表達水平，其中只有TEAD1在E+GSC中差異過(guò)表達。
此外，作者分析了所有TEAD家族成員(1-4)在TCGA數據庫RNA-seq數據中的表達水平，發(fā)現TEAD1是150個(gè)GBM樣本中表達最高的TEAD家族成員，且在蛋白水平上，TEAD1在PDX膠質(zhì)瘤中表達。因此，TEAD1是GBM腫瘤中表達最高、表達最廣泛的TEAD家族成員。
3、TEAD1的功能性作用
在體外實(shí)驗中，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除TEAD1/4，發(fā)現KO腫瘤細胞系的增殖與遷移受到抑制，而過(guò)表達TEAD1/4后則可增強其調控作用，促進(jìn)腫瘤細胞系的增殖與遷移。在體內實(shí)驗中，選擇體外抗遷移效果最強的TEAD1KO細胞系進(jìn)行異種移植，發(fā)現腫瘤浸潤的面積和體積均顯著(zhù)降低?？傊?，TEAD1是在GBM遷移中發(fā)揮重要作用的轉錄因子。
體外功能驗證
4、TEAD1調控的靶基因篩選
GSC中TEAD1可接近區域peak（ATAC-seq）和基因表達水平（RNA-seq）的一致性分析，結合GBM中TEAD1與基因共表達（TCGA中的GBM RNA-seq數據）分析，發(fā)現TEAD1的靶基因包括EGFR、AQP4、CDH4、TNC等多個(gè)候選靶基因。
作者利用不同亞型人GBM腫瘤樣本，通過(guò)ChIP-PCR對TEAD1的候選靶基因進(jìn)行驗證。進(jìn)一步結合TEAD1KO相比于對照的異種移植樣本中靶基因表達水平，EGFR、AQP4、CDH4在TEAD1KO樣本中表達下調，因此，TEAD1可能是通過(guò)結合靶基因EGFR、AQP4、CDH4調控其表達進(jìn)而參與GBM遷移。
5、TEAD1調控靶基因參與遷移的機制
TEAD1KO異種移植樣本中EGFR的表達水平低于對照樣本，且TEAD1KO細胞系中EGFR表達相比于正常對照細胞系顯著(zhù)下調，TEAD1過(guò)表達后EGFR表達有回升。對EGFR下游信號元件的表達水平的檢測發(fā)現，pERK在TEAD1KO細胞中下調，而pAKT則不同。TEAD1KO細胞經(jīng)過(guò)較長(cháng)時(shí)間的培養后，EGFR表達恢復，而遷移仍受影響。因此，TEAD1直接且短暫地調控EGFR。
在對照和TEAD1KO細胞中過(guò)表達AQP4后，細胞的遷移能力提高了~ 50%，說(shuō)明AQP4在GBM遷移中發(fā)揮了一定作用。且過(guò)表達TEAD1后不僅促進(jìn)細胞的遷移，同時(shí)也上調了AQP4的內源性表達。因此，TEAD1和其下游靶基因AQP4的表達在促進(jìn)原發(fā)性GBM細胞的遷移中存在直接的機制聯(lián)系。
小結
作者通過(guò)ATAC-seq繪制了膠質(zhì)母細胞瘤干細胞（GSC）和神經(jīng)干細胞（NSPC）的全基因組染色質(zhì)開(kāi)放區域圖譜，并結合轉錄組測序數據發(fā)現了在腫瘤細胞遷移中起關(guān)鍵作用的轉錄因子TEAD1，并通過(guò)細胞和異種移植模型水平上的TEAD1的敲除與過(guò)表達的體內外功能驗證實(shí)驗，驗證了TEAD1促進(jìn)遷移的功能性作用。
作者通過(guò)ATAC-seq和轉錄組測序數據篩選出來(lái)TEAD1的候選靶基因，并進(jìn)一步利用ChIP-PCR，驗證了與TEAD1結合的靶基因–AQP4、EGFR和CDH4。TEAD1敲除使AQP4下調，TEAD1過(guò)表達可恢復AQP4的表達，而TEAD1和AQP4過(guò)表達均可修復TEAD1KO細胞的遷移缺陷，說(shuō)明TEAD1作用于靶基因AQP4，調控其表達，進(jìn)而參與GBM遷移的直接調控機制。
文獻
Tome-Garcia J, Erfani P, Nudelman G, et al. Analysis of chromatin accessibility uncovers TEAD1 as a regulator of migration in human glioblastoma[J]. Nature Communications, 2018, 9(1).
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