《NC》cd8+t細胞：新LncRNA的表達可鑒定病毒特異的效應及記憶CD8+T細胞

研究背景

病毒感染后，CD8 +?T細胞擴增并分化成不同類(lèi)型的效應細胞，抗原遷移至炎癥部位殺死抗原表達細胞。 清除病毒后，大多數抗原特異性CD8+T細胞會(huì )死亡，但一小部分長(cháng)壽命的記憶細胞仍然存在。綜合性研究已經(jīng)確定了與該過(guò)程相關(guān)的蛋白編碼基因轉錄水平的變化。在效應時(shí)期，細胞可表達與增殖、遷移和細胞毒性相關(guān)的基因。病毒清除后，多數基因表達恢復初始狀態(tài)，但許多關(guān)鍵轉錄因子（Tbx21,Prdm1）、遷移因子（Cd44, Cxcr3）和細胞因子受體（Il12rb, Il18ra）的水平仍處于高水平以確?？煽焖倩謴托獱顟B(tài)。

更重要的是，小鼠和人在效應及記憶T細胞分化中已觀(guān)察到一些相似的基因程序。這些研究集中于編碼轉錄本的水平，但目前關(guān)于非編碼轉錄本在這一過(guò)程中的表達變化鮮有報道。作者基于之前工作采用RNA-seq展開(kāi)研究，以鑒定響應病毒感染的人和小鼠CD8 +?T細胞中長(cháng)非編碼RNA（lncRNA）表達的變化。通過(guò)lncRNA測序研究，鑒定出上百條未注釋的lncRNA，基于表達分析可以將lncRNA對初始、效應和記憶CD8+T細胞亞群分類(lèi)，意味著(zhù)在抗原啟動(dòng)分化過(guò)程中它們可能參與決定不同分化命運。通過(guò)小鼠與人類(lèi)lncRNA表達數據的比較，發(fā)現具有保守性的lncRNA。

材料和方法

●?LCMV感染及細胞分選： LCMV病毒感染小鼠，分選不同類(lèi)型的細胞進(jìn)行后續RNA測序。

●?LncRNA測序研究：基于RNA-seq進(jìn)行lncRNA表達分析。5組類(lèi)型細胞，包括native、終末分化效應T細胞（short-livedterminal effector ,TE）、記憶前體T細胞（memory precursor ，MP)、中心記憶T細胞（central memory ，CM) 、效應記憶T細胞（effector memory ，EM)，每組3個(gè)重復。

●?生信分析：轉錄本組裝、表達分析、同源性分析。

●?RACE驗證。

研究結果

1、通過(guò)小鼠CD8+T細胞測序數據，基于轉錄組組裝發(fā)現未注釋基因，以及T細胞分化過(guò)程中lncRNA的動(dòng)態(tài)變化。

從LCMV感染小鼠中分離病毒特異性的CD8+T細胞亞群，對不同類(lèi)型的細胞進(jìn)行RNA-seq。包括初始T細胞、終末分化效應T細胞（short-livedterminal effector ,TE）、記憶前體T細胞（memory precursor ，MP)、中心記憶T細胞（central memory ，CM) 、效應記憶T細胞（effector memory ，EM)?；跀祿M裝分析，共鑒定到13909個(gè)unique genes，75%是蛋白編碼基因，25%是非編碼。在非編碼基因中，三分之一在數據庫中未收錄，因為認為是新基因。這些新基因比已注釋非編碼基因有較高的表達水平，但這兩類(lèi)基因均比編碼基因低表達。采用CPAT進(jìn)行編碼潛能分析，大部分新轉錄本包括單個(gè)外顯子，不到25%的新轉錄本包括2個(gè)及以上外顯子。雖然不具有蛋白編碼潛能，但大部分新基因在CD8+T細胞分化過(guò)程中表現出特異性，包括記憶細胞中的特異性表達。

在13909基因中，與初始細胞相比，有5266個(gè)至少在一個(gè)細胞亞型中差異表達。感染過(guò)程中，884個(gè)lncRNA差異表達，其中有525個(gè)未注釋。在感染8天后的TE和MP細胞之間有181個(gè)差異非編碼基因，其中123個(gè)未注釋。48天后，378個(gè)非編碼（230新基因）與初始相比顯著(zhù)差異表達，但在CM和EM細胞相比，167個(gè)差異基因表達，29個(gè)為非編碼（20個(gè)新的）。

2、lncRNA表達分析分類(lèi)CD8+T細胞亞群。

由于在CD8+T細胞分化過(guò)程中表現出來(lái)的差異表達，進(jìn)一步通過(guò)PCA分析是否可以對不同亞群細胞分類(lèi)。結果表明編碼基因、非編碼和新基因均可以分類(lèi)。其中組裝得到的新基因分類(lèi)結果與編碼基因分類(lèi)結果一致，說(shuō)明這些新基因對T細胞的分化及功能的重要性。為進(jìn)一步鑒定特異性lncRNA，篩選具有類(lèi)似表達模式的差異基因。鑒定出14個(gè)差異表達的cluster，其中非編碼與編碼并未表現出cluster分離，表明二者有相似的表達過(guò)程。比如一些非編碼基因在CD8+T細胞激活后表達上調或下調，在記憶期維持效應水平，與編碼基因Cd44和Cd200類(lèi)似。第8天的MP和TE細胞相比，差異lncRNA存在于一些cluster中（clusters 4, 8, and 13 ），表明lncRNA可能涉及T細胞早期分化命運。

3、人抗原特異性CD8+T細胞中lncRNA的表達分析。

基于之前健康志愿者的測序數據（采用YFV-17D黃熱疫苗，分選CD8+T細胞，收集初始T細胞，14天CD8+T細胞、28天CD8+T細胞、記憶細胞），進(jìn)行轉錄組分析。鑒定出已注釋的3165個(gè)非編碼轉錄本，1098個(gè)未注釋的。與小鼠數據相比，人數據中也表現出編碼基因表達高于非編碼基因。同樣許多鑒定的新轉錄本是單外顯子，編碼潛能低于鼠鑒定的轉錄本。與小鼠數據類(lèi)似，許多新轉錄本在T細胞分化中表現出特異性。

基于差異分析，4099個(gè)基因至少在一個(gè)分化時(shí)期顯著(zhù)變化，838個(gè)是非編碼基因。28.3%的編碼基因在感染過(guò)程中顯著(zhù)變化。非編碼基因中，相比已知lncRNA，28.3%新lncRNA在感染后顯著(zhù)差異表達，已知lncRNA占比16.7%。接下來(lái)同樣進(jìn)行PCA分析lncRNA在分化過(guò)程中的作用。與小鼠數據相似，基于編碼基因、非編碼基因及新基因將T細胞分為3類(lèi)：初始、效應及記憶細胞。非編碼基因的分類(lèi)結果與編碼基因結果類(lèi)似?；诰垲?lèi)分析，有11個(gè)表達的cluster。與小鼠數據類(lèi)似，編碼基因與非編碼基因并未表現出cluster分離。并且有一些時(shí)期特應性的cluster，比如cluster3在激活后上調且在病毒清除后保持該水平，cluster2則恢復到初始狀態(tài)，cluster1則接近于初始水平。許多下調基因在記憶形成后恢復到初始水平（cluster11），但有些基因比初始狀態(tài)更低（cluster10）。結合小鼠測序數據，結果表明非編碼基因在多種哺乳動(dòng)物CD8+T細胞分化中發(fā)揮重要作用。

4、CD8+T細胞中lncRNA表達的保守性。

由于lncRNA在小鼠與人數據表現出的生物學(xué)過(guò)程相似性，將兩者轉錄本序列進(jìn)行比對。僅有一部分小鼠lncRNA包含人轉錄本同源序列，當然也會(huì )存在比對到人編碼基因及假基因上的序列。許多同源lncRNA在對比物種上有多個(gè)同源基因座。除了序列保守，共線(xiàn)性（位置保守）也是考慮因素。因此接下來(lái)分析T細胞分化過(guò)程中保守性的lncRNA。通過(guò)比較二者效應和記憶期基因的差異倍數，但在任一個(gè)階段未發(fā)現保守且表達顯著(zhù)相關(guān)的基因。但這些保守性基因在這2個(gè)時(shí)期表現出中度相關(guān)(r = 0.36 and 0.46, p = 0.0007 and 0.0008, respectively)。

小結

文章基于RNA測序對小鼠T細胞不同階段的基因表達進(jìn)行綜合比較，鑒定出不同階段特異表達的基因，包括已知和新的lncRNA，其可能參與作用于細胞分化過(guò)程。此外，通過(guò)與人的測序數據相比較，具有序列保守的lncRNA在二者間的表達類(lèi)似，表明在CD8+T細胞分化過(guò)程中的進(jìn)化保守性。

參考文獻

Hudson WH, Prokhnevska N, et al.?Expression of novel long noncoding RNAs defines?virus-specific effector and memory CD8+?T cells. Nature Communications, 2019.

 

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