2019年1月23日Journal of Hazardous Materials在線(xiàn)發(fā)表中國科學(xué)院植物研究所何振艷研究團隊“Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation”研究論文。本文通過(guò)三代全長(cháng)轉錄組、二代轉錄組和蛋白組聯(lián)合分析，闡述了蜈蚣草砷超富集調控機制。
中文題目：蜈蚣草砷超富集調控機制在植物修復中的潛在應用
英文題目：Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation
發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials
影響因子：6.434
研究背景
砷是一種自然界廣泛存在的有毒類(lèi)金屬元素。隨著(zhù)人類(lèi)和科技的發(fā)展，農藥、采礦等行為對土壤造成了嚴重的砷污染。砷可通過(guò)食物鏈從土壤富集到人體中，對人體造成極大的傷害。為保護人類(lèi)健康，維護糧食安全，亟需對土壤砷污染進(jìn)行治理。近年來(lái)，以砷超富集植物蜈蚣草為基礎的植物修復技術(shù)，為砷污染土壤的修復提供了新的低成本和環(huán)境友好的治理策略。
蜈蚣草是一種砷超富集的模式作物，具有極強的砷抗性和富集能力。據統計，蜈蚣草地上部分砷富集量可達23 g/ kg，且不影響其正常生長(cháng)，是價(jià)值極高的植物修復材料。目前，蜈蚣草組學(xué)信息的缺乏已成為其砷超富集機制研究的瓶頸，超富集過(guò)程關(guān)鍵分子元件的未知，極大的限制了植物修復技術(shù)的研發(fā)和推進(jìn)。
研究材料及方法
研究材料：蜈蚣草孢子體收集于湖北武漢，并在無(wú)砷培養土中長(cháng)至10cm左右。
研究方法：使用2 mM As(III) (NaAsO2)或2 mM As(V) (NaH2AsO4)作為試驗組進(jìn)行水培處理，24h后分別采集根部和地上部進(jìn)行測序。
測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司Illumina及Pacbio測序平臺。
研究結果
1 構建蜈蚣草“全長(cháng)轉錄組-液泡膜蛋白質(zhì)組”數據庫
SR-uXRF掃描結果顯示，使用As(III)/As(V)處理24h后，蜈蚣草可迅速吸收并將砷積累到體內。本研究使用PacBio RS-II 測序平臺，構建1-2、2-3和3-6 Kb三個(gè)文庫共8個(gè)cell，其測序長(cháng)度最長(cháng)達50kb，平均長(cháng)度3,111bp。使用Illumina 二代測序平臺共計獲得521M雙端reads,平均長(cháng)度為924bp。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)測序分析，共計獲得13,595個(gè)液泡膜肽段，可以匹配到轉錄組數據庫中的1,512個(gè)轉錄本。與NGS測序技術(shù)相比，使用Pacbio進(jìn)行三代測序可獲得更為完整的轉錄本，得到的轉錄本數量少但平均長(cháng)度更長(cháng)。使用二代數據對三代數據進(jìn)行校正后其轉錄本的質(zhì)量從0.598提升至0.906。綜上所述，在使用As(III)/As(V)處理后，共計獲得 69,615轉錄本，381個(gè)lncRNAs，1,482個(gè)可變剪切及1,512個(gè)可匹配轉錄本的肽段。將以上信息進(jìn)行整合，構建了蜈蚣草“全長(cháng)轉錄組-液泡膜蛋白質(zhì)組”數據庫。
圖1 不同處理下蜈蚣草砷累積水平及“全長(cháng)轉錄組–蛋白組”數據庫構建工作流程
2 As(III)/As(V)處理條件下蜈蚣草基因表達譜
對不同處理不同組織部位進(jìn)行兩兩比較（CKS-As(III)S、CKR-As(V)S、CKS-As(III)R和CKRAs(V)R），共計獲得4,601個(gè)差異表達基因。通過(guò)K-means算法進(jìn)行富集分析，6個(gè)cluster中的共2,997（65.1%）個(gè)DEGs在根和地上部出現相反的表達模式：其中k1、k3、k4和k6以地上部表達模式為主，其生物學(xué)功能包括光合作用等；而k2和k5以根部表達模式為主，參與ABC轉運等功能。
WGCNA組分分析可知，粉色和紫色模塊的地上部與As(III)處理顯著(zhù)相關(guān)，根部模塊中綠色和紫色模塊與As(III)處理顯著(zhù)相關(guān)，粉色模塊與As(V)處理的地上部顯著(zhù)相關(guān)，棕色模塊與As(V)處理的根部顯著(zhù)相關(guān)。通過(guò)KEGG富集分析發(fā)現，在所有的砷處理樣品中，均富集到GSH代謝（ko00480）和ABC轉運受體（ko02010）兩個(gè)通路。內質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工過(guò)程（ko04141）主要富集在砷處理的根部樣品中。因此，這些通路可能在蜈蚣草的砷超富集過(guò)程中扮演重要作用。
圖2 K-means聚類(lèi)及WGCNA組分分析
本研究共鑒定到包括已知PvTIP4;1、PvACR3和PvACR3;1在內的共2,248個(gè)轉運受體基因，其中226個(gè)與砷脅迫相關(guān)。與砷相關(guān)的絕大多數轉運受體與6個(gè)高表達的基因家族有關(guān)，包括ACR3 superfamily、ABC superfamily、MFS superfamily、P-type ATPase、NRT3 superfamily和MIP superfamily。其中ACR3 superfamily和ABC superfamily基因家族基因在砷處理樣品中表達量上調，MFS superfamily基因家族基因在根部As(V)處理組和地上部As(III)處理組表達量上調，P-type ATPase基因家族在地上部As(III)處理組表達量上調，NRT3 superfamily基因家族在根部As(V)處理組表達量上調，而MIP superfamily基因家族在A(yíng)s(III)S和As(V)R中表達下調。以上結果表明這些轉運蛋白家族對砷的轉運起到重要作用。
通過(guò)使用全長(cháng)轉錄本構建蛋白數據庫，對液泡膜蛋白進(jìn)行重新注釋?zhuān)舱业?3,595液泡膜蛋白肽段，比對到1,512個(gè)轉錄本，其中鑒定到包括P-type ATPase、MIP、MFS、ABC、丙糖-磷酸鹽和賴(lài)氨酸-蘇氨酸轉運受體8等6個(gè)轉運家族在內的119個(gè)液泡膜轉運蛋白。其中有四個(gè)轉運蛋白家族表現出高表達水平且與砷處理應答有關(guān)：絕大多數的 MIP和P-type ATPase轉運蛋白有著(zhù)更高的表達水平，而ABC和 MFS轉運蛋白則在砷刺激后在地上部或根部表達上調。以上結果表明這些轉運蛋白家族在液泡膜上對砷的超富集起到重要作用。
本研究表明，錯誤折疊蛋白降解和GSH代謝途徑在砷處理相關(guān)模塊中富集，為蜈蚣草的砷抗性機制提供了新思路。
內質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路（ERAD, ko04141）在所有與砷處理相關(guān)的模塊中顯著(zhù)富集程度最高。重金屬會(huì )導致細胞內的蛋白錯誤折疊而引起內質(zhì)網(wǎng)的應激。內質(zhì)網(wǎng)蛋白降解通路（ERAD）和泛素蛋白酶體通路（UPP）可降解錯誤折疊蛋白的合成而維持細胞健康。在進(jìn)行砷處理后，所有與內質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因并未被激活，而參與ERAD和UPP通路的基因則表達量上調，且根部基因表達水平高于地上部。根部是直接與環(huán)境中的砷接觸部位，其錯誤蛋白降解能力的提高，可保證根部的正常代謝，進(jìn)而賦予其較強的砷抗性。
GSH代謝通路也在所有的砷處理樣品中富集。在植物中，GSH可作為抗氧化劑阻止ROS損傷。在本研究中，GSH合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶GSH1和GSH2并未明顯受到砷處理的影響，而GST轉錄本的表達量則在砷處理后顯著(zhù)上調。GST可通過(guò)谷胱甘肽與亞砷酸鹽結合而介導砷-硫醇化合物的形成。蜈蚣草有著(zhù)很強的砷-GSH絡(luò )合物的合成能力，但其絡(luò )合物量卻很少，因此有可能存在高效的“As(GSH)3絡(luò )合-區隔化-降解”過(guò)程。一旦As(GSH)3進(jìn)入液泡而GST不足，由于砷-硫醇類(lèi)化合物的高度不穩定性，可能發(fā)生不可逆降解，從而使得As(GSH)3含量很低。而蜈蚣草高效的‘砷絡(luò )合-區隔化’系統能阻止細胞質(zhì)內的砷損害，進(jìn)而增加蜈蚣草對砷的抗性。
本研究共鑒定到1,482個(gè)可變剪接事件，并分為六類(lèi)包括：內含子保留（RI）、外顯子跳躍（SE）、最后外顯子可變剪切（AL）。第一外顯子可變剪切（AF）、3’端可變剪接位點(diǎn)（A3）和5’端可變剪接（A5）。WGCNA分析結果共分為四個(gè)模塊（橙色、綠色、藍色，灰色）。在地上部，所有樣本都與橙色模塊相關(guān)，而在根部，綠色模塊與As(III)R顯著(zhù)相關(guān)，藍色模塊與AS(V)R顯著(zhù)相關(guān)。對不同模塊進(jìn)行KEGG富集分析得知，內質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路和GSH代謝兩個(gè)最重要的通路，顯著(zhù)富集在綠色模塊。通過(guò)PCR對相關(guān)可變剪切進(jìn)行鑒定，結果表明可變剪切極大的豐富了轉錄本的數量，在錯誤折疊蛋白降解過(guò)程和GST的表達上起調控作用。
總結
小編寄語(yǔ)
全長(cháng)轉錄組測序利用Nanopore或Pacbio三代測序平臺進(jìn)行的測序，可借助其超長(cháng)讀長(cháng)優(yōu)勢，無(wú)需組裝，直接獲得全長(cháng)轉錄本，準確鑒定基因的可變剪接、APA、融合基因、基因家族和非編碼RNA等信息。此外，全長(cháng)轉錄組和蛋白組聯(lián)合分析是近兩年研究熱點(diǎn)，一方面可以構建蛋白搜索數據庫，全面準確地對蛋白進(jìn)行鑒定和定量；另一方面對可變剪切事件進(jìn)行相互驗證。
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