單細胞轉錄組測序技術(shù)之：10× Genomics技術(shù)及優(yōu)缺點(diǎn)

小編之前已經(jīng)跟大家簡(jiǎn)單介紹過(guò)了單細胞轉錄組測序的一些相關(guān)知識，并提到了在單細胞轉錄組前期，主要依賴(lài)三種方法：SMART-seq2技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。? 現在就跟大家詳細介紹一下其中10×genomics單細胞轉錄組測序技術(shù)以及單細胞轉錄組測序優(yōu)缺點(diǎn)。

10x Genomics單細胞技術(shù)

ChromiumTM Single Cell 3′ Solution是基于10 X Genomics平臺，能夠一次性分離、并標記500–10000個(gè)單細胞，并能在單細胞水平進(jìn)行檢測的技術(shù)，其通過(guò)微流控系統，將單細胞或長(cháng)片段DNA分子快速分配到油包水的微反應體系中，每個(gè)微反應體系中的單DNA分子會(huì )獲得唯一的特異性分子標簽，制備生成的測序文庫可以在illumina平臺進(jìn)行測序，并由10x Genomics提供數據分析及可視化軟件，測序實(shí)驗及分析流程可以和illumina系統無(wú)縫銜接。該平臺廣泛應用于3’單細胞轉錄組測序、基因組組裝應用、免疫組庫測序、ATAC-seq、人全基因組及全外顯子組測序。

10x Genomics單細胞轉錄組測序有效地解決了組織樣本無(wú)法破解的細胞異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現新的細胞類(lèi)型；并基于大量的單細胞基因表達數據，可以提供細胞表達特征聚類(lèi)、亞群表達特征的分析、標志物篩選等方面的分析，是一種高效的單細胞基因表達水平檢測技術(shù)。

10x Genomics單細胞轉錄組測序優(yōu)缺點(diǎn)

 

10x Genomics單細胞轉錄組測序優(yōu)點(diǎn)

1、簡(jiǎn)單便捷：集單細胞分選、擴增、建庫于一體；

2、細胞通量高：每個(gè)樣本細胞數可達500-10000個(gè)；

3、建庫周期短：1天可完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、擴增及建庫；

4、超高捕獲效率：?jiǎn)渭毎东@效率高達65%；

5、真正意義的單細胞：?jiǎn)蝹€(gè)液滴捕獲到多個(gè)細胞的概率極低（0.9%/1000cells）；

6、價(jià)格實(shí)惠：相較于其它單細胞平臺，價(jià)格實(shí)惠。

10x Genomics單細胞轉錄組測序缺點(diǎn)

1、非全長(cháng)信息：只能獲得3’端轉錄本信息；

2、樣本要求高：?jiǎn)蝹€(gè)樣本細胞起始量達10^5-10^6個(gè)，活細胞數目需超過(guò)80%，建議在90%以上最佳。

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10x Genomics單細胞轉錄組測序流程

 

單細胞懸浮液制備

↓

細胞質(zhì)檢

↓

10 X genomics 標記cDNA 片段化

↓

文庫構建

↓

Illumina 測序

↓

數據分析

單細胞樣本檢測

將樣本制成單細胞懸浮液，用Countess? II Automated Cell Counter 進(jìn)行細胞計數和細胞活率測定，細胞活性高于80%，并將細胞濃度調整到理想濃度（1000個(gè)/μL）。

實(shí)驗流程

1）將制備好的單細胞懸浮液與含有barcode信息的凝膠珠以及酶的混合物結合，然后在微流體“雙十字”中進(jìn)行液滴包裹，從而形成GEMs（Gel Bead-In-EMulsions），有效GEMs中包含膠珠（膠珠中有預制的10x引物）、單細胞、和Master Mix。然后，在GEMs內進(jìn)行細胞裂解和逆轉錄反應。有效GEMs中，10X Barcode將與cDNA產(chǎn)物連接在一起，接下來(lái)再將GEMs破碎并打碎油滴，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，cDNA擴增完成以后，針對擴增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢（擴增片段大小以及擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量）。

2）擴增產(chǎn)物質(zhì)檢合格以后，進(jìn)行測序文庫的構建。首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200-300bp 左右的片段，cDNA片段化、末端修復和加A，進(jìn)行cDNA片段篩選，P7 Adaptor接頭連接并通過(guò)PCR擴增引入樣品Index，最后進(jìn)行片段篩選從而得到cDNA文庫。

3）文庫完成以后進(jìn)行庫檢，庫檢合格以后，利用Illumina測序平臺進(jìn)行測序，獲得測序數據，并進(jìn)行后續的數據分析。

 

10x Genomics 單細胞轉錄組測序應用方向

 

核心：細胞群體的劃分與細胞群體間差異表達基因的檢測

多種細胞類(lèi)型：組織類(lèi)細胞、免疫細胞、血液細胞、癌組織細胞、神經(jīng)類(lèi)細胞等

?廣泛應用方向：免疫方向、腫瘤方向、病理分型、干細胞方向、發(fā)育生物學(xué)（神經(jīng)、腦、胚胎等）、細胞圖譜繪制……

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10x Genomics作為單細胞領(lǐng)域的后起之秀，巧妙使用了Barcoding（條形碼）和Microfluidics（微流體）技術(shù)，在單細胞分離、擴增原理上具有明顯的優(yōu)勢。為科研需要提供了高質(zhì)量的技術(shù)支持，如果大家想要了解關(guān)于10x Genomics 單細胞技術(shù)的更多內容，請點(diǎn)擊這里：>>10x Genomics 單細胞技術(shù)

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