英文題目：Exploring the fate of mRNA in aging seeds: protection, destruction, or slow decay?
發(fā)表雜志：Journal of Experimental Botany
影響因子：5.354
發(fā)表時(shí)間：2018年6月
研究背景
種子的壽命有限，主要取決于物種，生長(cháng)條件和儲存環(huán)境。當種子處于脆弱的狀態(tài)時(shí)，無(wú)法修復機體遭受的化學(xué)降解，這會(huì )使種子慢慢老化并最終導致死亡。在種子老化機制涉及的生物分子中，已經(jīng)檢測干燥儲存的種子總RNA的降解與活力喪失同時(shí)發(fā)生。為了鑒定mRNA的特異性變化，該研究采用新的Nanopore全長(cháng)轉錄組測序技術(shù)檢測了大豆（Glycine max）種子的轉錄組。
材料方法
材料：大豆（Glycine max，cv.’Williams 82’）種子；
全長(cháng)轉錄組：采用1994年和2015年收獲的種子胚胎軸（分別為1994H和2015H），分別5個(gè)生物學(xué)重復；
測序平臺：Nanopore MinION；
研究結果
1、種子萌發(fā)和RNA質(zhì)量
2015年收獲的大豆種子保持高萌發(fā)率，2016年和2017年萌發(fā)率均為100％，而1994年收獲的種子顯示出老化跡象。1994H胚軸的總RNA的電泳圖具有較低的25S和18SrRNA峰值比（分別為47和41.5 s），且在峰間（42.8-45.9 s）和快速（27.25-41 s）區域內峰值略高（圖1A）。相對于2015H種子poly（A）mRNA長(cháng)度為1000-3000bp，1994H種子大多數長(cháng)度為1000-2000bp（30-37s），（30-41s）（圖1B）表明其向低分子量分子轉移。
測序結果顯示，每個(gè)flowcell的測序數據量超過(guò)2百萬(wàn)個(gè)cDNA分子，約97％的分子被轉換為核苷酸序列，共保留了3,559,336個(gè)具有barcode的序列。1994H和2015H樣本之間的平均reads沒(méi)有顯著(zhù)差異。1994H或2015H樣品中分別比對到參考轉錄組的reads數量相似（分別為1 649 345和1 819 173）。1994H種子中3409個(gè)轉錄本特異表達，2015H種子中4127個(gè)轉錄本特異表達。參考基因組轉錄本長(cháng)度和測序轉錄本呈正相關(guān)。1994H的相關(guān)性較弱，特別是對于較長(cháng)的轉錄本，表明轉錄本長(cháng)度短于預期（圖2B）。
圖2. 10個(gè)樣品中11 729個(gè)轉錄本的參考轉錄本和測序轉錄本長(cháng)度比較
3、mRNA降解模式
通過(guò)每個(gè)堿基的讀數，將2211個(gè)轉錄本分成不同的降解模式（圖3）。在2015H和1994H樣品中，未顯示降解跡象的轉錄本表現出幾乎一樣的測序深度，在儲存期間降解的轉錄本在2015H樣品中具有恒定的測序深度，而在1994H樣品中靠近3’末端的測序深度增加（圖3B），或者在兩個(gè)群組中測序深度以不同的速率增加（圖3C）。 無(wú)論儲存時(shí)間如何，轉錄本長(cháng)度都與降解相關(guān)。
圖3. 比較2015H和1994H每個(gè)位置的轉錄本reads之間的平均歸一化測序深度
? ? ? 區域A在儲存23年后無(wú)變質(zhì)跡象，其中172個(gè)轉錄本小于1200 bp。區域A’包含1149個(gè)轉錄本，大多數（853）轉錄本小于1200 bp，剩余的轉錄本長(cháng)度1200-2500bp。區域B包括114個(gè)轉錄本，在2015H樣品中比較完整但是在1994H樣品中降解，大多數（108）具有中等長(cháng)度。區域C在1994H樣品中的降解多于2015H樣品。長(cháng)轉錄本61個(gè)，中間轉錄本38個(gè)。無(wú)小于1200bp 的轉錄本。區域D包括最初降解的104個(gè)轉錄本，在23年的儲存期間幾乎沒(méi)有變化。64個(gè)轉錄本具有可變剪接模式。在區域A的轉錄本中，20個(gè)GO term顯著(zhù)表達，主要與核糖體功能和翻譯有關(guān)。區域C中，轉錄本具有顯著(zhù)的ATP結合term和相關(guān)功能的過(guò)表達。
圖4. 隨時(shí)間發(fā)生的降解與在儲存早期發(fā)生的降解之間的關(guān)系
4、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸氧化
來(lái)自5’末端的轉錄本降解可以反映年齡相關(guān)的RNA氧化。最容易氧化的堿基，8-oxo-guanosine的豐度與總RNA中鳥(niǎo)苷豐度的比例與1989,1995,1999和2015年收獲的大豆種子胚軸的貯藏時(shí)間無(wú)關(guān)（圖5）。
圖5. 大豆種子胚軸貯藏時(shí)間中RNA的氧化
5、 qPCR驗證
通過(guò)qPCR的方法對區域A（無(wú)降解）的三種轉錄本和區域B的三種轉錄本（僅在1994H種子組織中顯著(zhù)降解）的完整性進(jìn)行驗證，結果顯示：區域A的轉錄本，在組內cDNA文庫中5’和3’擴增的cDNA模板相似，且三個(gè)cDNA文庫ΔCt值沒(méi)有差異，樣本2015H和1994H之間有較小差異。與完整轉錄本相反，對于易于降解的轉錄本，ΔCt值在群組之間顯著(zhù)不同（區域B）。在1994H樣品中，5’比3’擴增模板豐度低，產(chǎn)生負ΔCt值，在2015H樣品中，兩種擴增模板豐富度相似。
圖6. 使用qPCR驗證轉錄本降解
討論
在相隔21年的種子的胚軸中比較mRNA的降解，2015H和1994H分別顯示未衰老和增加衰老癥狀。使用全分子cDNA無(wú)打斷的測序方法對RNA進(jìn)行測序。發(fā)現一些轉錄本在兩個(gè)群組中均有降解，但在1994H種子的組織中觀(guān)察到更多的損傷。損傷主要由于片段碎裂造成，如電泳圖譜的變化，轉錄本覆蓋長(cháng)度和測序深度所示。幾乎沒(méi)有證據表明轉錄本丟失或引起了氧化損傷。降解轉錄本中片段大小的連續分布以及轉錄本長(cháng)度和降解之間的正相關(guān)支持了通過(guò)隨機片段化造成mRNA降解的假設，這與氧化事件引起死亡的假設一致。
參考文獻：
Fleming M B , Patterson E L , Reeves P A , et al. Exploring the fate of mRNA in aging Seeds: Protection, Destruction, or Slow Decay?[J].?Journal of Experimental Botany, 2018, 69(18):4309-4321.
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