ATAC-seq+RNA-seq 聯(lián)合分析揭示斜帶石斑魚(yú)性逆轉過(guò)程中染色質(zhì)的可及性

ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析，可以獲得ATAC檢測到的染色質(zhì)高度可及性區域與對應轉錄本表達的相關(guān)性，以及對應轉錄本相關(guān)基因的上游調控序列，構建TF結合后的基因表達調控機制，從而整體分析該特定時(shí)空下從DNA到RNA的調控網(wǎng)絡(luò )，并且相互驗證，進(jìn)一步結合基因功能分析、實(shí)驗表型進(jìn)行討論，清晰展現從表觀(guān)調控——基因表達——基因功能——表型的生物學(xué)過(guò)程。百邁客擁有完善的ATAC-seq與轉錄組聯(lián)合分析流程，云平臺配套專(zhuān)業(yè)豐富的分析工具，輕松滿(mǎn)足您的個(gè)性化分析需求！接下來(lái)，小編以一篇文獻為例帶領(lǐng)大家深刻認識ATAC-seq與轉錄組聯(lián)合分析方案。

文章信息

中文標題：ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析揭示了斜帶石斑魚(yú)性逆轉過(guò)程中染色質(zhì)的可及性

英文標題：Integration of ATAC-seq and RNA-seq Unravels Chromatin Accessibility during SexReversal in Orange-Spotted Grouper (Epinephelus coioides)

影響因子：6.208

期刊：International Journal of Molecular Sciences

研究目的

采用ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析斜帶石斑魚(yú)（雌雄同體）性腺在性逆轉過(guò)程中的開(kāi)放染色質(zhì)區域和TF結合位點(diǎn)，以探究斜帶石斑魚(yú)性逆轉的分子機制。

研究亮點(diǎn)

• ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析構建TFs及其靶基因的復雜網(wǎng)絡(luò )、探索性逆轉過(guò)程的潛在機制。
• 整體分析斜帶石斑魚(yú)性逆轉過(guò)程中從DNA到RNA的調控網(wǎng)絡(luò )，為斜帶石斑魚(yú)的基因組分析以及其他表觀(guān)遺傳學(xué)信息分析奠定基礎資料。
• ATAC-seq+RNA-seq+實(shí)驗驗證，清晰展現從表觀(guān)調控-基因表達-基因功能-表型的生物學(xué)過(guò)程。

研究背景

石斑魚(yú)（Epinephelus）是雌雄同體的魚(yú)類(lèi)，在其生活史中經(jīng)歷了從雌性到雄性的性別變化，是研究性別分化和性別逆轉的良好模型。斜帶石斑魚(yú)是亞洲重要的經(jīng)濟石斑魚(yú)物種，其在自然條件下，于大約4-5齡時(shí)會(huì )改變性別。然而，斜帶石斑魚(yú)的性逆轉的分子機制仍不清楚。以往的研究表明，許多轉錄因子，如sox（性別決定區Y-box）、wnt（無(wú)翅基因/整合基因）、dmrt（dsx和mab-3相關(guān)轉錄因子）和nanos，在性逆轉過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用。然而，對性逆轉過(guò)程中的轉錄變化仍缺乏全面的了解。

染色質(zhì)結構在維持基因表達的調控中起著(zhù)關(guān)鍵作用，可接近的染色質(zhì)區域是轉錄因子（TFs）和順式元件的結合位點(diǎn)。因此，來(lái)自這些開(kāi)放區域的信息將增強我們對TF結合、染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達調控之間關(guān)系的理解。ATAC-seq是2013年開(kāi)發(fā)的一種新方法，已在許多研究中廣泛應用于檢測開(kāi)放染色質(zhì)區域。該文首次在斜帶石斑魚(yú)性逆轉期間使用ATAC-seq對性腺的原始細胞核進(jìn)行檢測，揭示不同發(fā)育階段染色質(zhì)可及性的差異，以便從一個(gè)新的角度探索性逆轉的機制。作者采用ATAC-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，以確定性逆轉過(guò)程中幾個(gè)途徑中的TFs網(wǎng)絡(luò )和核心基因。此外，在這一過(guò)程中還發(fā)現了一組與性別相關(guān)的基因。

研究方法

材料：斜帶石斑魚(yú)（體重1.90±0.65kg，體長(cháng)43.75±9.25cm）分為兩組，對照組（n=25）和MT植入組（10mg/kg;n=25）（廣東大亞灣漁業(yè)發(fā)展中心），水池養殖（T：22.7–27.8?C）。

實(shí)驗方法：MT誘導的性逆轉：在植入前（第0周），隨機獲得5條魚(yú)的性腺以確定發(fā)育階段。MT植入后，每周分別從兩組中隨機抽取5條魚(yú)的性腺組織（每條魚(yú)的性腺切成三部分），實(shí)驗進(jìn)行5周。性腺的增殖檢測：免疫組織化學(xué)IHC分析；胞凋亡的檢測：TUNEL分析；組織定量表達：RT-qPCR；基因定位：原位雜交ISH。

測序策略：ATAC+轉錄組

研究結果與分析

一、斜帶石斑魚(yú)的人工性別逆轉以及性逆轉過(guò)程中性腺的增殖檢測和胞凋亡的檢測

MT處理前，石斑魚(yú)仍處于初級生長(cháng)卵母細胞（PO）和皮質(zhì)肺泡期卵母細胞（PVO）豐富的階段（圖1a）。在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，對照組石斑魚(yú)的性腺也保持在同一階段（圖1b、d、f）。相反，MT植入組的石斑魚(yú)從雌性變?yōu)樾坌?。在組織學(xué)上，MT植入后一周，性腺中的卵母細胞退化，新的生精囊腫增生，這被定義為性逆轉的早期階段（第1周；圖1c）。植入后三周，性腺進(jìn)入性逆轉中期，其特征是大量精原細胞（SG）和精母細胞（SCs）以及數量有限的卵母細胞（第3周；圖1e）。植入后5周，性腺進(jìn)入性逆轉后期，擁有大部分雄性生殖細胞，與自然睪丸相似（第5周；圖1g）。

為了研究MT誘導的性逆轉過(guò)程中性腺中的增殖信號，采用免疫組織化學(xué)（IHC）檢測增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。在對照組中，PCNA信號主要位于體細胞中（圖2a）。在性逆轉早期，在新發(fā)育的雄性生殖細胞中觀(guān)察到PCNA陽(yáng)性信號（圖2b）。在性逆轉中期，PCNA信號主要在男性生殖細胞中檢測到（圖2c）。在性逆轉后期，僅在SG和SC中觀(guān)察到信號（圖2d）。此外，作者采用TdT介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）來(lái)檢測卵母細胞的凋亡情況。結果表明，在正常卵巢中很難檢測到TUNEL信號（圖3a）。在性逆轉的早期，在一些卵母細胞和體細胞中可以發(fā)現TUNEL陽(yáng)性信號（圖3b）。在性逆轉中期，TUNEL陽(yáng)性信號更強，僅在卵母細胞中觀(guān)察到（圖3c）。在性逆轉后期，信號出現在幾個(gè)細胞中，這些細胞可能是體細胞或假陽(yáng)性信號（圖3d）。以上結果表明斜帶石斑魚(yú)在人工性別逆轉過(guò)程中，卵母細胞發(fā)生凋亡，而雄性生殖細胞則出現增殖。

圖1+2+3人工性別逆轉以及性腺的增殖檢測和胞凋亡的檢測注：PO：初級生長(cháng)期卵母細胞；PVO：皮質(zhì)肺泡期卵母細胞；SG：精原細胞；SC：精母細胞；ST：精細胞。

二、ATAC-seq和RNA-seq數據結果概述

作者聯(lián)合ATAC-seq和RNA-seq研究斜帶石斑魚(yú)在性逆轉過(guò)程中可獲得的染色質(zhì)、基因表達譜以及它們之間的關(guān)系。斜帶石斑魚(yú)性腺組織被分為三組：MT植入一周（中間組I）、MT植入后五周（睪丸組T）和未植入MT（對照組C）。ATAC-seq數據顯示平均比對率為73.34%，每個(gè)樣品有12.7百萬(wàn)個(gè)合格片段（圖4b）。所有文庫片段長(cháng)度都如預期所示，包括大多數小片段（<200bp，為核小體間開(kāi)放染色質(zhì)）和逐漸減少的大片段(≥200bp，系跨越核小體的開(kāi)放染色質(zhì))（圖4c）。在A(yíng)TAC-seq檢測到的假定易接近區域中，超過(guò)50%位于轉錄起始點(diǎn)（TSS）上游2kb處，尤其是TSS上游1kb處的啟動(dòng)子，約32%位于遠端基因間區域，其余18%位于基因體的內含子、外顯子和基因下游（圖4d）。此外，確定的可接近區域大多富集在TSS的2kb范圍內（圖4e），這與斜帶石斑魚(yú)這些區域中存在順式調控元件（啟動(dòng)子、增強子、沉默子等）相一致。

研究發(fā)現ATAC-seq峰在幾個(gè)性別相關(guān)基因附近高度富集。hsd17b7（羥基類(lèi)固醇（17β）脫氫酶7）附近的峰值在睪丸組中顯著(zhù)富集，但在對照組和中間性組中未檢測到（圖5a）。ATAC分析發(fā)現在三個(gè)發(fā)育階段的性腺中檢測到4552個(gè)共同峰和無(wú)數特有的峰（圖5b）。轉錄組分析顯示在六個(gè)樣本中檢測到534個(gè)共有基因（圖5c），組間比較結果顯示：與中間性組相比，對照組中有1291個(gè)上調基因和7個(gè)下調基因；與睪丸組相比，對照組共檢測到2888個(gè)上調基因和326個(gè)下調基因；與中間性組相比，睪丸組有984個(gè)上調基因和843個(gè)下調基因（圖5d）。

三、差異可及區域中高度富集的已知基序及其靶基因

為了確定染色質(zhì)可及性差異的潛在驅動(dòng)因素，作者篩選出差異可及區域與組成性開(kāi)放區域相比的前十個(gè)上調TF基序的富集情況，并列出了對照組與中間性組中前十個(gè)基序的富集和DNA序列（圖6a）。其中，*豐富的基序是ZNF263（鋅指蛋白263）、SPIB（轉錄因子）和RFX4（調節因子×4）。在可接近染色質(zhì)區域聚集的ZNF263全位點(diǎn)附近檢測到TF占用的相對清晰的足跡（圖6b）。ZNF263與基本細胞過(guò)程相關(guān)，很少有研究確定ZNF263在生殖方面的作用。該研究結果表明，ZNF263在性逆轉過(guò)程中調用了大量的性相關(guān)基因，暗示ZNF263可能通過(guò)對其靶基因的轉錄調控在性逆轉中發(fā)揮重要作用。在*豐富基序的目標基因中，許多基因與性逆轉相關(guān)，形成TF基因網(wǎng)絡(luò )。研究發(fā)現許多TF結合基因參與細胞增殖、細胞分化和類(lèi)固醇合成，包括zbtb16、dmrt1、sox11、star（類(lèi)固醇生成急性調節蛋白）和hsd17b7。為了說(shuō)明潛在的調控網(wǎng)絡(luò )，作者在對照組和中間性組的比較中繪制了ZNF263、SPIB、ETV2及其靶基因的網(wǎng)絡(luò )圖（圖6c）。

四、性別相關(guān)差異表達基因（DEG）的表達水平

研究發(fā)現已知的TFs基序以高度性別優(yōu)先的方式富集（圖7）。氣泡圖顯示了與性逆轉相關(guān)的30個(gè)DEG的富集和表達情況，這30個(gè)DEG對性腺發(fā)育和性調節至關(guān)重要，包括bmp15、cyp19a1、daz（l刪除活力缺乏精子）、dnd、dmrt1-3、foxl2、nanos2-3、piwil1和sox9。此外，基序出現的時(shí)間與相應基因的表達一致。例如，MT植入5周后，dazl和dmrt2及他們結合的基序在性腺中強烈富集。研究還發(fā)現dnd、nanog、nanos3和SAL4在卵巢和雌性偏好的中間性腺中顯著(zhù)性表達，而dmrt1、gas8、piwil1和star的表達水平在睪丸中顯著(zhù)。

五、RT-qPCR驗證數據推斷的DEG

在30個(gè)DEG中，對12個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR，以驗證轉錄組數據的可靠性，并分析性別逆轉期間基因的表達模式。結果表明，這些基因的表達模式與轉錄組數據基本一致。卵巢中bmp15、dnd、gdf9和nanog的表達顯著(zhù)高于睪丸，并且在性逆轉期間其表達逐漸降低（圖8a、d、e、g）。睪丸中dmrt1、nr5a2、star（類(lèi)固醇生成急性調節蛋白）、sox9（性別決定區Y-box9）和rergl（ras相關(guān)和雌激素調節生長(cháng)抑制物樣基因）的表達顯著(zhù)高于卵巢，尤其是MT植入后五周的性腺（圖8b、f、j、k、l）。

六、性相關(guān)基因的定位

用原位雜交（ISH）技術(shù)分析了不同性腺階段性相關(guān)基因（dazl、Dmrt1、star、rergl）的定位。dazlmRNA僅限于斜帶石斑魚(yú)的雌性和雄性生殖細胞（卵母細胞、SG和SC）表達（圖9a、b），結果表明dazl是一種生殖細胞標記物，在睪丸中高表達，這與其他物種中dazl的表達一致。在自然雌性的卵巢中未檢測到Dmrt1信號（圖9d）。性逆轉后期的性腺有豐富的雄性生殖細胞SG、SC和ST，帶有dmrt1陽(yáng)性信號，而卵母細胞沒(méi)有dmrt1信號（圖9e），因此dmrt1可以被認為是斜帶石斑魚(yú)的生殖細胞標記。star作為合成類(lèi)固醇激素途徑中的限速酶，其在雄性斜帶石斑魚(yú)的睪丸中特異表達，而在卵母細胞中未檢測到star信號（圖9g）。此外，發(fā)現starmRNA在SG、SC和ST中表達（圖9h）。rerglmRNA僅在雄性生殖細胞中檢測到（圖9j，k），這與RT-qPCR結果一致，暗示其在性別調節中的潛在作用。dazl、dmrt1、star和rergl的雜交探針作為對照實(shí)驗顯示性腺中沒(méi)有信號（圖9c、f、I、l）。

七、根據性逆轉早期的RNA序列推斷ATAC-seq的核心峰

分析ATAC-seq和RNA-seq的相關(guān)性，以探索轉錄活性的變化，并捕獲性逆轉早期的關(guān)鍵轉錄因子。圖10a列出了前20個(gè)KEGG富集途徑，如賴(lài)氨酸降解途徑、肌動(dòng)蛋白細胞骨架調節途徑等。在雌激素信號通路中，對照組與中間性組相比有17個(gè)DEG，比如gnas、grb2、esr2（雌激素受體β）等。在這些基因中，我們在A(yíng)TAC-seq的相同比較結果中只發(fā)現了gnas的峰值，它位于通路的上游。gnas的峰值由ZNF263調節，這表明gnas染色質(zhì)的變化可能是觸發(fā)該通路中下游基因差異表達的核心基因。在卵母細胞減數分裂途徑中檢測到13個(gè)DEGs，包括PKA、SMC1和PGR等，然而，在A(yíng)TAC-seq數據中僅發(fā)現ccnb2峰。在人工性逆轉過(guò)程中，參與類(lèi)固醇激素生物合成的幾種酶，如HSD17B1和CYP19A發(fā)生了顯著(zhù)變化。除CYP21A外，大多數DEG的表達均低于對照組（圖10b）。CYP21A是將類(lèi)固醇轉化為皮質(zhì)醇的關(guān)鍵酶，據報道，?？~(yú)的皮質(zhì)醇在性轉變期間表達達到峰值，這表明皮質(zhì)醇在性逆轉中起作用。然而，本研究結果表明雌激素和雄激素的合成受到抑制，而在人工誘導的性逆轉過(guò)程中，腎上腺皮質(zhì)酮的合成上調，這為斜帶石斑魚(yú)的性逆轉提供了新的見(jiàn)解。

總結

該研究首次采用高靈敏度的ATAC-seq方法對性逆轉期間的斜帶石斑魚(yú)進(jìn)行了開(kāi)放性染色質(zhì)分析。這項技術(shù)可以定位潛在的基因調控區域。通過(guò)ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，我們確定了許多不同發(fā)育階的新的性別相關(guān)基因。對ATAC-seq鑒定的開(kāi)放染色質(zhì)區域的進(jìn)一步挖掘揭示了重要TFs與下游基因的網(wǎng)絡(luò )，以及染色質(zhì)可及性的變化，這些變化可能在性逆轉中起重要作用。本研究為今后的研究提供了重要的數據集和多種新的研究途徑。

參看文獻：

XiWu,YangYangandChaoyueZhongetal.,IntegrationofATAC-seqandRNA-seqUnravelsChromatinAccessibilityduringSexReversalinOrange-SpottedGrouper(Epinepheluscoioides)[J].Internationaljournalofmolecularsciences,2020,21(8):2800