利用OxfordNanopore長(cháng)讀長(cháng)RNA-Seq對發(fā)育中橄欖果蠅胚胎的轉錄組學(xué)研究

英文題目：Transcriptome landscape of the developing olive fruit fly embryo delineated by Oxford Nanopore long-read RNA-Seq

中文題目：利用OxfordNanopore長(cháng)讀長(cháng)RNA-Seq對發(fā)育中橄欖果蠅胚胎的轉錄組學(xué)研究

研究背景

橄欖果蠅或橄欖蠅（Bactroceraoleae）是栽培橄欖樹(shù)主要的害蟲(chóng)，像所有的昆蟲(chóng)一樣，橄欖蠅會(huì )完全變態(tài)。然而，尚未探索早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的轉錄動(dòng)力學(xué)，而在沒(méi)有完全注釋的基因組的情況下進(jìn)行詳細的轉錄組學(xué)分析具有挑戰性。收集發(fā)育前6個(gè)小時(shí)每小時(shí)的橄欖蠅胚胎進(jìn)行ONT測序，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得3100萬(wàn)reads，與橄欖蠅基因組比對效率在98%，全長(cháng)覆蓋率大于50%，在發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)中檢測到68％的預測的基因的表達。鑒定了3553個(gè)新基因和共79,810個(gè)轉錄本，與NCBI預測的轉錄組相比，轉錄組多樣性增加了四倍。胚胎發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)的特征在于顯著(zhù)的轉錄組變化，每個(gè)胚胎的轉錄物總數從胚胎發(fā)育的第一小時(shí)到第二小時(shí)降至一半?；跁r(shí)間共表達的基因聚類(lèi)，在胚胎發(fā)育的前六個(gè)小時(shí)表達的基因的基因集富集分析顯示參與轉錄和翻譯，大分子生物合成和神經(jīng)發(fā)育的基因高度富集?？傊?，cDNA分子的全長(cháng)測序詳細表征同種型復雜性和B.oleae的第一胚胎階段的轉錄動(dòng)力學(xué)。

結果分析

1、目前B.oleae基因組組裝和基因組注釋

橄欖蠅有六對染色體，其中包括一對異色性染色體，雄性為異性性染色體，最初通過(guò)qPCR估計B.oleae基因組大小在322Mb左右。作者之前提交過(guò)一版本基因組，該注釋包含總共13936個(gè)基因和假基因，其中,分別被預測為蛋白質(zhì)編碼13198，非編碼392和假基因346。此外，預測2,759個(gè)基因具有可變剪接。而基因和轉錄本的平均長(cháng)度分別為9,597bp和2,259bp，長(cháng)的基因為497,921bp，而長(cháng)的轉錄本為59,475bp。

2、橄欖蠅的轉錄組測序鑒定出新的基因和亞型

作者獲得了3100萬(wàn)次reads，其中使用Canu對2200萬(wàn)reads（71％）進(jìn)行了錯誤糾正，只關(guān)注全長(cháng)reads，通過(guò)確定為具有5’引物和poly（A）和3’引物的序列全長(cháng)序列。ToFU轉錄組結果包含總共11,883個(gè)基因和79,810個(gè)亞型（表北京百邁客生物科技有限公司1），其中8330個(gè)基因與NCBI注釋基因匹配，而3553個(gè)基因是新的。所有這些都對應于橄欖蠅轉錄組在同種型水平上比當前NCBI注釋的四倍擴增。針對UniprotSwiss-prot數據庫的預測蛋白質(zhì)序列的搜索顯示高比對的是雙翅目，其次是哺乳類(lèi)動(dòng)物（圖1B）。盡管鑒定了3553個(gè)新基因，但預計只有269個(gè)含有開(kāi)放閱讀框。與注釋基因相比，超過(guò)50％的新基因是單外顯子，其中超過(guò)80％的基因是多外顯子并且還包含更高百分比的單同種型基因。且新基因的表達量要低于已注釋基因。在結構上，SQANTI根據其剪接點(diǎn)和基因組坐標將轉錄本分為9類(lèi)，分別為FSM，ISM，NIC，NNC，基因組基因，反義，融合，基因間區和基因內含子（圖1E）。

3、RNA-Seq數據的直接標準化優(yōu)于相對標準化

為了獲得轉錄數，在cDNA合成步驟中以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用的每個(gè)胚胎數的恒定比率添加ERCC內部加標RNA標準。在測序和比對后，通過(guò)2個(gè)步驟實(shí)現標準化，使用Mandalorion對測序深度進(jìn)行相對標準化，得到每10000個(gè)映射讀數的每個(gè)基因讀數的轉錄本豐度（RP10K），我們注意到我們的RNA標準品的相對標準化豐度隨時(shí)間變化，這很可能是由于胚胎中poly（A）RNA含量的變化（圖2A）。在第二步中，我們使用ERCC標準生成的標準曲線(xiàn)將我們的相對計數轉換為每個(gè)胚胎的計數。在這里，我們注意到ERCC標準并沒(méi)有隨著(zhù)時(shí)間點(diǎn)的不同而發(fā)生顯著(zhù)的變化（圖2B）。有趣的是，與相對表達相反，當所有基因的每個(gè)胚胎的轉錄物的數量相加并在時(shí)間點(diǎn)上繪圖時(shí)（圖2C和D），該譜與每個(gè)胚胎產(chǎn)生的cDNA相似（補充圖4A），因此驗證標準化方法。相鄰時(shí)間點(diǎn)北京百邁客生物科技有限公司顯示出比遠距離時(shí)間點(diǎn)更高的基因表達相關(guān)性，其中連續樣本的Spearman相關(guān)性始終等于或高于0.96。

4、胚胎的總mRNA含量和生物學(xué)重復驗證絕對定量

通過(guò)將每個(gè)胚胎的每個(gè)基因的所有轉錄物相加并計算以毫微克計的當量來(lái)計算每個(gè)胚胎的總mRNA（圖3A），總mRNA在1hpo時(shí)從1.2ng/胚胎下降至2hpo時(shí)為0.61ng/胚胎，然后在3hpo時(shí)增加至1.49ng/胚胎，然后在6hpo采樣結束時(shí)降至0.93ng/胚胎，反映了每個(gè)胚胎的總轉錄本（圖2D）。假設2-5％的總RNA是多腺苷酸化的，mRNA水平與我們在每個(gè)胚胎中獲得的總RNA產(chǎn)量一致。

進(jìn)一步尋求確定觀(guān)察到的表達模式是否可以在不同的生物樣品組中重復并使用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），這是當前用于量化基因表達的標準方法。然而，qPCR基因表達的相對方法需要鑒定內參基因其表達在樣品間保持穩定。使用作者的數據來(lái)確定這些常見(jiàn)內參基因以及GAPDH的表達水平的變化，評估了3個(gè)基因的qPCR表達;SRY，HID和LINGERER，用RPL19和14-3-3zeta作為內參基因，在不同的生物重復樣品組中（跳過(guò)6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)）。我們觀(guān)察到類(lèi)似的基因表達趨勢（特別是14-3-3zeta與RPL19相比）。為了進(jìn)一步探索表達譜，我使用差異表達的明顯的基因進(jìn)行主成分分析（PCA）和層次聚類(lèi)分析，第一個(gè)主成分將前3個(gè)時(shí)間點(diǎn)與最后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分開(kāi)，分層聚類(lèi)進(jìn)一步表明前3個(gè)和后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)是分別共同聚類(lèi)的。

5、母體到受精卵轉變表明胚胎mRNA含量發(fā)生了顯著(zhù)變化

線(xiàn)蟲(chóng)，昆蟲(chóng)，魚(yú)類(lèi)，兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物在內的許多后生動(dòng)物的發(fā)育胚胎的特征在于顯著(zhù)的轉錄變化，其中之一是胚胎依賴(lài)從母體到受精卵轉錄物的變化。MZT過(guò)程包括兩個(gè)階段，首先是在卵子發(fā)生過(guò)程中清除大部分母本轉錄本和最初加載到卵母細胞中的蛋白質(zhì)，然后開(kāi)始受精卵轉錄。在黑腹果蠅中，MZT已被廣泛研究，胚胎依賴(lài)于母體轉錄本和蛋白質(zhì)直至受精后2-3小時(shí)。然而，在MZT期間，在2hpf結束時(shí)，母系編碼的蛋白質(zhì)中有多達20％的母系供應的轉錄物不穩定，而另外15％的母本轉錄本通過(guò)化學(xué)編碼的蛋白質(zhì)3hpf不穩定。黑腹果蠅母系不穩定基因富含細胞周期功能，而母系穩定基因則富含家族保持功能，如代謝，翻譯。

使用我們的時(shí)間進(jìn)程數據來(lái)闡明MZT在B.oleae中的作用機制，這個(gè)過(guò)程在我們所知的范圍之前還沒(méi)有被研究過(guò)。我們在檢測跨時(shí)間點(diǎn)的發(fā)育過(guò)程中每個(gè)胚胎的總mRNA含量時(shí)發(fā)現了一個(gè)有趣的現象（圖3A），與1hpo時(shí)相比，2hpo時(shí)每胚胎的總mRNA下降51％，3hpo時(shí)相比2hpo時(shí)增加143％。實(shí)際上，表達基因的數量在1,2和3hpo之間是相似的，使用時(shí)間進(jìn)程的數據，利用GFOLD在連續時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行差異表達，GFOLD是為沒(méi)有生物重復的樣品設計的，已顯示GFOLDlog2倍數變化與qPCR確定的倍數變化相關(guān)性較好。使用±0.5的Gfold截止值將基因編碼為上調或下調。確定了1496個(gè)基因，這些基因在2hpo時(shí)比1hpo下調。這些基因富含母體降解的轉錄物，在此稱(chēng)為母體降解的基因。實(shí)際上，在1hpo時(shí)，母體降解基因的表達水平高于其他基因的表達水平，與其他基因相比，相同基因在2hpo時(shí)表現出相似的表達水平，表明這些基因不穩定至其他基因的基礎水平。

我們對3個(gè)類(lèi)別基因集進(jìn)行富集分析;母體降解基因，受精卵基因和母體穩定/上調基因。母體降解基因也是1hpo中表達高的基因，富含細胞過(guò)程，發(fā)育和新陳代謝（圖6）。母體降解的基因也富含轉錄因子，例如DREF，BEAF-32A，PNR，它們是相應的果蠅同源基因。類(lèi)似母體降解基因，母體穩定/上調基因在翻譯，生物合成過(guò)程，基因表達，代謝過(guò)程等方面得到豐富，反映了快速生長(cháng)胚胎的高代謝活性，DREF轉錄因子也在這些基因中富集。受精卵基因富含特定的組織形成和發(fā)展過(guò)程，包括：后腸發(fā)育，模式規范，消化道形態(tài)發(fā)生等功能。

6、基于時(shí)間表達動(dòng)態(tài)的基因聚類(lèi)

基因表達是一個(gè)嚴格調控的過(guò)程，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，基因表達的時(shí)空動(dòng)態(tài)調控對器官的正常發(fā)育至關(guān)重要?；谄鋾r(shí)間表達動(dòng)力學(xué)的基因聚類(lèi)不僅將表達基質(zhì)的復雜性降低為簡(jiǎn)單的基因集，而且還可以鑒定具有與先前所示相似的生物學(xué)功能的基因。實(shí)際上，我們鑒定了在不同時(shí)間點(diǎn)表達達到峰值的基因，證明了高度動(dòng)態(tài)的轉錄本動(dòng)力學(xué)，并表明這些基因在確定的發(fā)育期間具有特定的作用（圖7）。我們進(jìn)一步將這些集群分為3組;1）基因在3hpo達到峰值并且通常隨時(shí)間降低，稱(chēng)為早期基因（圖7A），2）基因，其表達維持3-5hpo，稱(chēng)為中間基因（圖7B和C），和3）基因其表達僅在5和/或6hpo時(shí)增加，稱(chēng)為晚期基因（圖7D）。富集顯示，如先前在母體類(lèi)別的基因中所觀(guān)察到的，早期基因和中間基因在細胞過(guò)程和代謝過(guò)程中富集，而晚期基因在專(zhuān)門(mén)的發(fā)育過(guò)程中富集。

7、長(cháng)讀長(cháng)RNA-Seq完善了基因在性別決定途徑中的注釋

雙翅目昆蟲(chóng)的性別決定機制在很大程度上是相同的，在果蠅（Drosophilamelanogaster）中，性別決定機制已被廣泛研究，性致死基因（sxl）作為主要調節因子，根據性染色體與常染色體的比例，調節本身和變異基因（tra）的性別特異性選擇性剪接。tra反過(guò)來(lái)調節性別特異性雙重性別的選擇性剪接（dsx），這是級聯(lián)的最后一個(gè)成員和性別差異發(fā)育的中介。B.oleae同源物已經(jīng)鑒定了sx1，tra和dsx。然而，主要的調控方式仍然難以捉摸。已經(jīng)提出橄欖蠅的性別決定在胚胎發(fā)育的前6小時(shí)內發(fā)生，并且通過(guò)類(lèi)似于黑腹果蠅中的性別決定機制的tra和dsx的可變剪接來(lái)調控。在轉錄組數據中，我們能夠觀(guān)察到tra和dsx的各種可變剪接。使用來(lái)自成年雄性和雌性頭部的數據來(lái)識別性別特異性亞型。在dsx的情況下，與成齡相比，早期發(fā)育階段的亞型復雜性顯著(zhù)不同。在數據中，看到具有不同轉錄起始位點(diǎn)和長(cháng)度較長(cháng)的亞型，因為在發(fā)育的早期胚胎階段存在突出的亞型（圖8），成齡頭部組織中的這些亞型轉移到較短的亞型中，外顯子4存在于雌性中但不存在于雄性中。由于我們無(wú)法在早期胚胎階段檢測到這些性別特異性亞型，我們認為它們的表達在發(fā)育過(guò)程后期開(kāi)始。然而，它們在后期階段的積累代表了在發(fā)育早期階段激活的性別調控系統。北京百邁客生物科技有限公司。

討論

由于受精卵的興趣和令人費解的性質(zhì)，胚胎發(fā)育已在模型生物中廣泛研究。然而，在生物中沒(méi)有很好表征，長(cháng)讀長(cháng)RNA-seq有可能揭示迄今未知的基因，完善注釋信息，并擴展亞型多樣性。作者匯集了混合性別橄欖果蠅（Bactroceraoleae）胚胎，這些胚胎在產(chǎn)卵的前6個(gè)小時(shí)后每小時(shí)收集一次。這些時(shí)期的研究很有意義，因為之前對B.oleae的研究表明，在此期間開(kāi)始通過(guò)基因的可變剪接介導的性別決定機制。此外，來(lái)自地中海實(shí)蠅（Ceratitiscapitata）的證據表明，在此期間發(fā)生極細胞（原始生殖細胞）的建立，因此，在此期間闡明轉錄狀態(tài)非常重要。

作者在轉錄組中包括雄性和雌性頭部以擴展轉錄組數據?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的轉錄分析工作提供了豐富的資源來(lái)識別早期發(fā)育基因和轉錄異構體以及一系列廣泛的可變剪接變體。