人多能干細胞與食蟹猴離體胚胎的嵌合體研究

摘要

用人多能干細胞（hPSC）形成種間嵌合體已成為在體內評估hPSC多能性的有效方案，并且 可能在再生醫學(xué)，包括移植器官和組織再生中發(fā)揮重要作用。使用小鼠和豬胚胎的研究表明， hPSCs并不能有力地促進(jìn)與人類(lèi)進(jìn)化距離較遠的物種的嵌合體形成。本研究主要是在體外培養的 食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎中研究人擴展多能干細胞（hEPSC）的嵌合能力，證明 hEPSCs能夠在食蟹猴胚胎中存活、增殖，并繪制植入前后細胞圖譜。同時(shí)還發(fā)現了種間細胞相 互作用，這些事件可能有助于塑造嵌合胚胎內人類(lèi)和食蟹猴細胞的獨特發(fā)育軌跡。本研究結果 可能有助于更好地了解早期人類(lèi)胚胎發(fā)育和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)化，并制定策略以改善進(jìn)化距離較遠 的物種的人類(lèi)嵌合體的形成。

研究背景

多能干細胞（PSC）能夠進(jìn)行無(wú)限的自我更新并產(chǎn)生所有成體細胞類(lèi)型（De Los Angeles et al., 2015; Hackett and Surani, 2014; Rossant and Tam, 2017; Wu and Izpisua Belmonte, 2016）。PSCs 可通過(guò)囊胚互補進(jìn)行種間器官再生，這種技術(shù)有潛力為包括器官移植在內的再生醫學(xué)提供大量 體內生成的人類(lèi)細胞、組織和器官（Suchy and Nakauchi, 2018; Wu et al., 2016）。成功的種間囊 胚與人類(lèi) PSC（hPSC）互補的要求之一是它們能夠形成嵌合體。hPSCs的嵌合能力已在幾種物 種中進(jìn)行了測試（Wu et al., 2016），雖然不同實(shí)驗室都在持續努力，但普遍的共識是在與人類(lèi) 進(jìn)化距離很遠的物種上（e.g., mice and pigs; Wu et al., 2016, 2017），hPSCs 并不能始終如一地、 有力地促進(jìn)嵌合體的形成，即使人類(lèi)細胞凋亡受到抑制，結果也是一樣（Das et al., 2020; Huang et al., 2018; Wang et al., 2018）。hPSCs和進(jìn)化距離很遠的物種之間的異種屏障被認為是限制嵌合 體形成的原因（Wu et al., 2016, 2017），但尚無(wú)hPSCs與進(jìn)化上接近人類(lèi)的物種中進(jìn)行嵌合體的研究。體外培養的PSC反映了體內多能性，體外不同的細胞培養方案導致細胞不同的多能性狀態(tài) （Morgani et al., 2017; Smith, 2017; Weinberger et al., 2016）。處于不同多能狀態(tài)的hPSC表現出不 同的轉錄、表觀(guān)遺傳和代謝特征，當它們被引入動(dòng)物胚胎時(shí)，它們的嵌合潛力也不同（De Los Angeles, 2019; Harvey et al., 2019; Zhang et al., 2018）。最近研究發(fā)現人類(lèi)擴展多能干細胞 （hEPSC）在小鼠中表現出較高的嵌合能力（Gao et al., 2019; Yang et al., 2017）， 然而尚未在其 他物種中確定hEPSCs的嵌合能力。 利用新開(kāi)發(fā)的培養體系，食蟹猴胚胎可離體培養長(cháng)達20天（Ma et al., 2019; Niu et al., 2019）。將hEPSCs顯微注射到食蟹猴囊胚中，并在不同時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察其對食蟹猴胚胎的作用（見(jiàn) 下圖），結果發(fā)現hEPSCs可以整合到晚期食蟹猴囊胚的內細胞團（ICMs）中，同時(shí)還通過(guò)單細 胞轉錄組測序（scRNA-seq）分析確定了體外培養過(guò)程中食蟹猴胚胎中hEPSCs的分化軌跡。

材料方法

卵母細胞采集和體外受精

參考已發(fā)表文章（Mishra et al., 2010）進(jìn)行卵巢刺激、卵母細胞恢復和體外受精。健康雌 性食蟹猴通過(guò)肌肉注射20 IU重組人促卵泡激素α（rhFSH, Gonal F, Merck Serono）8 天，然后 在第9天注射1,000 IU重組人絨毛膜促性腺激素α（rhCG, OVIDREL, Merck Serono）刺激卵 泡。在給予rhCG后32-35小時(shí)，通過(guò)腹腔鏡收集卵丘-卵母細胞復合物。將卵泡內容物置于 37℃含有0.3%牛血清白蛋白（BSA）的Tyrode乳酸丙酮酸白蛋白（TALP）培養基中，在短暫
暴露于透明質(zhì)酸酶（<1 分鐘）后，在TALP-HEPES中通過(guò)移液器將卵母細胞剝離出卵丘細胞 （0.5 mg/mL），選擇核成熟中期II（MII；存在第一個(gè)極體）卵母細胞。成熟的卵母細胞立即 進(jìn)行卵胞漿內單精子注射（ICSI），然后在37℃含有5% CO2的10% 胎牛血清（FBS, GIBCO） 的CMRL-1066培養基（GIBCO, 11530037）中培養，第二極體和兩個(gè)原核的生成證實(shí)了體外受 精成功，然后將受精卵在含有5% CO2的10% 胎牛血清的HECM-9培養基中37℃下培養。除非 另有說(shuō)明，所有試劑均來(lái)自 Sigma Chemicals。

將hEPS細胞顯微注射到食蟹猴囊胚并進(jìn)行體外胚胎培養

將受精后第6天的囊胚（早期囊胚）轉移到覆蓋有3 mL礦物油的培養皿中心的50 mL TH3液 滴中。將hEPS細胞的單細胞懸浮液注入10 uL培養基液滴中。將25個(gè)tdTomato陽(yáng)性hEPS細胞吸入 內徑為30°斜口的15 mm注射移液管中。使用單個(gè)激光脈沖消融透明帶，并將含有hEPS細胞的 注射移液管立即插入囊胚的孔中，靠近 ICM。將注射的囊胚快速轉移到HECM-9和hEPS（1:1） 的混合培養基中（Yang et al., 2017b），并培養24小時(shí)至膨脹良好的囊胚階段。

人猴嵌合胚胎體外培養

選擇tdTomato陽(yáng)性人猴嵌合胚胎進(jìn)行后續實(shí)驗。人猴嵌合胚胎的透明帶可通過(guò)暴露于來(lái)自 牛睪丸的透明質(zhì)酸酶約30 s而去除，然后將胚胎接種在含有IVC1培養基的8孔板（80826，Ibidi） 中。胚胎附著(zhù)在孔上后，將一半的IVC1更換為IVC2培養基，此后，每天用新鮮的IVC2更換一半 的培養基，并在指定的日期收獲猴胚胎。IVC1和IVC2的成分見(jiàn)已經(jīng)發(fā)表文章（Niu et al., 2019）。

單細胞收集和單細胞RNA-seq (scRNA-seq)

用磷酸緩沖液（PBS）（MA0008，美倫生物）洗滌后，用1mL注射器將胚胎切成幾塊。在 熒光顯微鏡（Leica）下挑取tdTomato陽(yáng)性和陰性組織，用0.1%胰蛋白酶（25200-072，GIBCO） 在37°C消化3-5分鐘制成單細胞懸液。2% FBS（04-002-1A, Biological Industries）中和后，用含 有0.1至1% BSA的預冷PBS洗滌細胞。最后，使用熒光顯微鏡用吸管將單個(gè)tdTomato陽(yáng)性和陰性 細胞挑入冰上預冷的裂解緩沖液中。

通過(guò)吸管將單細胞放入裂解緩沖液中，逆轉錄反應和預擴增分別使用SuperScript II（18064- 071, Invitrogen）和KAPA HiFi HotStart Ready Mix（KK2602, KAPA Biostems）進(jìn)行，然后進(jìn)行20 個(gè)PCR循環(huán)以獲得20-140 ng的cDNA。通過(guò)Tn5轉座酶（TD502/TD501，Vazyme）在 55°C混合10 分鐘將cDNA片段化，然后使用TruePrep 擴增酶（TD601，Vazyme）進(jìn)行PCR擴增，用AM Pure XP 磁珠（A63881, Beckman Coulter）純化文庫并進(jìn)行大小選擇。所有文庫均適用于Illumina X- Ten測序平臺（由Annorad測序）。

免疫熒光（IF）

IF參考之前發(fā)表的內容（Niu et al., 2019）。收獲體外培養的人猴嵌合胚胎，在4%（w/v） 多聚甲醛（BL539A，Biosharp）的PBS溶液中室溫固定30分鐘，用PBS洗滌。d.p.f.9胚胎直接染 色，d.p.f.11至19的胚胎在蔗糖（BGC005，美倫生物）溶液中脫水6小時(shí)，濃度從15%（w/v）增 加到30%（w/v），使用OCT（4583，Tissue-Tek OCT，SAKURA）包埋，-80℃冷凍，將胚胎制 備為8 mm厚的冷凍切片后，放在預處理過(guò)的載玻片（1A5105，CITOTEST）上，風(fēng)干1小時(shí)。在 室溫下PBST（含 0.3% Triton X-100 的 PBS）（T9284，Sigma-Aldrich）中透化30分鐘，樣品用 3%（w/v）BSA 和10%（v/v）FBS 封閉（04-001-1A, Biological Industries）在PBS 中，4℃下與一 抗一起孵育過(guò)夜，然后洗滌至少3次后，熒光偶聯(lián)的二抗、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）與 載玻片在室溫下避光孵育2小時(shí)。使用Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

統計分析

所有值均表示為平均值±SD，包括圖例和補充圖例中統計分析、統計顯著(zhù)性和n值在內的 統計參數。使用Prism軟件（GraphPad）進(jìn)行統計分析，采用單向方差分析，顯著(zhù)性p < 0.05。

細胞來(lái)源識別、scRNA-seq數據預處理和質(zhì)量控制

首先通過(guò)兩種不同的方法識別人和猴細胞。 一種是隨機選擇的10000條reads通過(guò)blastp與人 類(lèi)或食蟹猴基因組（Ensembl Homo_sapiens.GRCh38和Macaca_fascicularis_5.0）進(jìn)行比對；另一 個(gè)是比對到tdTomato序列的測序reads。在確定細胞來(lái)源后，使用hisat2（Kim et al., 2019）將測序 reads比對到人類(lèi)或猴子基因組，使用StringTie（Pertea et al., 2015）組裝轉錄本，并計算基因表 達量（TPM）。

細胞聚類(lèi)、譜系鑒定

Seurat包（v.3.1.1）（Butler et al., 2018）用于單細胞聚類(lèi)分析，并用t-SNE來(lái)可視化結果。 參考數據集包括Human-1（Zhou et al., 2019）、Human-2（Xiang et al., 2020）、monkey-1（Niu et al., 2019）和monkey-2（Nakamura et al., 2016）。除非另有說(shuō)明，Control-monkey的參考數據集為 monkey-1。本研究中的嵌合體數據按照以下步驟整合到上述參考數據集中，首先，將這些數據 集分別創(chuàng )建為Seurat對象，順序為Human-1、Human-2、monkey-1、chimera-human和chimera- monkey；然后使用“FindIntegrationAnchors”函數將這些對象作為輸入，參數為“k.anchor = 5， anchor.features = 2000”；最后使用“IntegrateData”函數將所有數據集與默認參數進(jìn)行整合。 Seurat使用前20個(gè)主成分（PC）進(jìn)行聚類(lèi)（分辨率為 0.6），每個(gè)cluster使用“FeaturePlot”函數 在t-SNE圖上突出顯示的特定標記基因定義，并由先前研究中的已知譜系證實(shí)。

差異基因鑒定

通過(guò)運行Seurat的“FindAllMarkers”和“FindClusters”功能（p <0.01）來(lái)鑒定獨特的cluster 特異性表達基因。K-近鄰算法SPRING（Weinreb et al., 2018）用于軌跡分析，以集成數據、2000
個(gè)高度可變基因（HVG）和默認參數作為輸入。為了構建所有嵌合細胞的系統發(fā)育樹(shù)，將基因 表達矩陣輸入MEGA (X 10.1)（Kumar et al., 2018）構建系統發(fā)育樹(shù)。

擬時(shí)序分析和擬時(shí)序依賴(lài)性差異表達基因分析

Monocle2（v2.12.0）（Trapnell et al., 2014）用于構建所有EPI細胞的擬時(shí)序分析。用EPI譜 系 中 人 、 猴 和 嵌 合 細 胞 的 2000 個(gè) HVG 和 表 達 數 據 用 作 Monocle2 的 輸 入 ， 通 過(guò) 參 數 “max_components=2”的“reduceDimension”函數降低維度，將表達數據投影到低維空間后， 通過(guò)“orderCells”函數對細胞進(jìn)行排序，最后使用DTW算法來(lái)對齊人類(lèi)、食蟹猴和嵌合細胞之 間的不同擬時(shí)序過(guò)程，如先前研究（Kanton et al., 2019）中所述。擬時(shí)序對齊數據后，使用基于 F檢驗的ANOVA分析來(lái)識別具有擬時(shí)序依賴(lài)性表達模式的基因，如前所述（Kanton et al., 2019）。對于每個(gè)HVG，建立一個(gè)具有六個(gè)自由度（df）的自然線(xiàn)性回歸模型（R包splines中的 ns函數），以表達水平作為響應變量，偽時(shí)間作為自變量。對測試基因進(jìn)行Bonferroni校正，校 正P值為0.01。此外，R包slingshot（v1.1-2）用于推斷具有默認設置的嵌合人類(lèi)EPI-like細胞和 hEPS的潛在發(fā)展軌跡（Street et al., 2018）。

GO和KEGG分析

使用clusterProfiler R包（Yu et al., 2012）進(jìn)行KEGG通路（Kanehisa, 2019; Kanehisa and Goto, 2000; Kanehisa et al., 2019）和GO富集分析，P≤0.05被認為是顯著(zhù)富集的。使用R包中“ggplot” 函數進(jìn)行可視化。

單細胞轉錄因子調控網(wǎng)絡(luò )構建

SCENIC 包（Aibar et al., 2017）可用于推斷和表征嵌合體細胞scRNA-seq數據的基因調控網(wǎng) 絡(luò )。根據網(wǎng)站（https://github.com/aertslab/SCENIC）的指導手冊，共三個(gè)步驟：1.基于嵌入式 GENIE3的轉錄因子與潛在目標基因推斷之間的共表達網(wǎng)絡(luò )；2.對于每個(gè)共表達模塊，RcisTarget 對所有潛在靶基因進(jìn)行順式調控motif富集分析，每個(gè)轉錄因子及其靶基因被定義為一個(gè)調節 子；3.通過(guò)AUCell計算每個(gè)細胞中每個(gè)調節子的活動(dòng)分數。本研究將所有嵌合細胞的表達譜輸 入SCENIC，以推斷它們的AUC調節子活性，然后嵌合細胞基于它們的調節子活性和pheatmap （v1.0.10）的“pheatmap”功能進(jìn)行聚類(lèi)。為了比較，上述數據集Human-1和monkey-1也使用相 同的調節子活性分析。

RNA速度分析

RNA速度是使用Velocyto.R程序（http://velocyto.org）根據之前報道的拼接和未拼接轉錄本 reads計算的（La Manno et al., 2018）。Velocyto使用BAM文件來(lái)計算拼接和未拼接的reads，并 生成Loom 文件，然后使用“read.loom.matrices”函數將這些文件加載到R中，以生成用于拼接 和非拼接讀取的計數表，使用具有K-近鄰細胞池（kCells = 10）的基因相關(guān)模型估計RNA速度。

嵌合胚胎內人和猴細胞間相互作用的鑒定

使用CellPhoneDB（v2.0.1）基于配體-受體對，分析不同胚胎譜系中人和猴細胞之間的信號 傳遞（Vento-Tormo et al., 2018）。CellPhoneDB中所有配體-受體相互作用數據庫都用于本次數 據分析。將所有嵌合細胞的表達譜及其信息，包括細胞類(lèi)型（人類(lèi)或猴細胞）和譜系信息 （EPI、HYP 和 EXMC）輸入 CellPhoneDB，以推斷兩種類(lèi)型細胞之間的潛在相互作用。使用校 正后的P＜0.05作為閾值來(lái)識別兩種類(lèi)型細胞之間特異性表達的配體/受體，其他參數設置為默認 值。為了進(jìn)行比較，上述數據集Human-1和monkey-1也進(jìn)行相同分析。

結果

1、體外人猴嵌合囊胚的形成

為確定非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中hPSC的嵌合能力，本研究使用了通過(guò)細胞重編程產(chǎn)生的特征明 確的hEPSC系iPS1-EPSC，它在小鼠胚胎第10.5天（E10.5）表現出優(yōu)于其他hPSC（Yang et al., 2017）的嵌合性。與之前的報告一致，iPS1-EPSCs表現出圓頂形集落形態(tài)，并表達核心多能性 轉錄因子OCT4、NANOG和SOX2（圖 S1A）。為了生成人猴嵌合胚胎，對食蟹猴的早期囊胚 （受精后 6 天 [d.p.f.6]）注射了25個(gè)用tdTomato（TD）標記的iPS1-EPSC，注射的胚胎培養到 晚期囊胚階段（d.p.f.7）進(jìn)行分析，發(fā)現食蟹猴囊胚內hEPSC的增殖很明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，在所 有d.p.f.7的食蟹猴囊胚中檢測到TD+ iPS1-EPSCs（100%，n = 132）（圖 S1B）。

圖S1 宿主食蟹猴胚胎中hEPSCs的譜系規范

2、hEPSCs在食蟹猴胚胎中的嵌合作用

最新建立的延長(cháng)胚胎培養系統可支持靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物（人和猴）的離體胚胎發(fā)育到原腸胚階段 （Deglincerti et al., 2016; Ma et al., 2019; Niu et al., 2019; Shahbazi et al., 2016; Xiang et al., 2020;Zhou et al., 2019）。在這個(gè)胚胎培養系統中，透明帶被去除，裸露的囊胚附著(zhù)在培養皿上進(jìn)一 步發(fā)育，可使用該系統來(lái)追蹤移植前后食蟹猴胚胎中hEPSC的分化。大約d.p.f.10左右，注射了 hEPSCs（92.79%, n = 111）的胚胎與未注射的對照（92.31%, n = 104）（Niu et al., 2019）類(lèi) 似。附著(zhù)后，注射的胚胎繼續生長(cháng)，胚胎盤(pán)在大約d.p.f.11時(shí)變得可見(jiàn)（圖 1B）。在d.p.f.9 時(shí)，超過(guò)一半的胚胎中發(fā)現了TD+人類(lèi)細胞，但這個(gè)比率在d.p.f.13時(shí)逐漸下降約1/3（圖 1C）。為了確定引入的hEPSC是否會(huì )影響胚胎發(fā)育，本研究評估并比較了注射胚胎和對照胚胎 的發(fā)育狀態(tài)（Niu et al., 2019），發(fā)現注射胚胎的發(fā)育比率略低于對照（圖 1D）。此外，與對 照類(lèi)似，注射胚胎的發(fā)育比率在大約 d.p.f.15 時(shí)急劇下降，這可能反映了2D附著(zhù)胚胎培養系統 的局限性（圖 1D）。

圖1 人猴離體嵌合體的產(chǎn)生和發(fā)育能力

為研究食蟹猴胚胎中hEPSC的發(fā)育潛力，本研究使用幾種胚胎和胚胎外譜系特異性抗體進(jìn) 行了免疫熒光（IF）研究。在圍植入期（d.p.f.9），平均有10.2±7.2（n = 9）個(gè)iPS1-EPSCs被 發(fā)現（在NANOG+或OCT4+食蟹猴細胞內或附近發(fā)現TD+ OCT4+細胞）（圖 2A）。盡管這些 細胞表達OCT4，但只有少數細胞表達NANOG（圖 S1C），沒(méi)有在這些細胞中觀(guān)察到GATA6 表達（一種下胚層【HYP】標記）（圖 S1C）。 此外，還檢測到TD+GATA4+ HYP-like細胞 （圖 2B）。與小鼠中報道的結果相反（Yang et al., 2017），在食蟹猴囊胚的滋養外胚層 （TE）層中僅檢測到少數iPS1-EPSC表達了TE標記基因（例如TFAP2C和CK7）（圖 2C）。 在d.p.f.11時(shí)，食蟹猴胚胎的EPI層也檢測到TD+OCT4+細胞，這些細胞很少表達原腸胚形成標志物T+（也稱(chēng)為Brachyury）。相比之下，在胚胎的背側羊膜處檢測到T+食蟹猴細胞（圖 2D）。此外，在食蟹猴HYP細胞內發(fā)現表達HYP標志物、血小板衍生生長(cháng)因子受體-α （PDGFRα）的TD+人類(lèi)細胞（圖 2E）。在EPI層外發(fā)現了表達COL6A1的OCT4+人類(lèi)細胞， COL6A1是胚胎外間充質(zhì)細胞（EXMC）的標志物，表明hEPSC正在向EXMC分化（圖 S1D）。在 d.p.f.13時(shí)，EPI層下方檢測到hEPSCs并表達內胚層標記物SOX17，表明它們已啟動(dòng) 原腸胚形成（圖 2F）。有趣的是，本研究發(fā)現從d.p.f.13開(kāi)始，人類(lèi)細胞傾向于聚集在一起并 與食蟹猴EPI層分離，通過(guò)檢測OTX2和OCT4的表達，發(fā)現這些人類(lèi)細胞似乎已分化為原腸細 胞（Martyn et al., 2018; Vincent et al., 2003）（圖 S1E）?？偟膩?lái)說(shuō)，hEPSCs對EPI的貢獻較高 （在d.p.f.15時(shí)的最高貢獻值為7.08%），對HYP的貢獻相對較低（在d.p.f.19時(shí)的最高貢獻為 4.96%）（圖 2G）。

圖2 hEPSCs有助于植入后食蟹猴胚胎中的嵌合體形成

3、人猴嵌合胚胎的轉錄圖譜

為進(jìn)一步描繪人猴嵌合胚胎的發(fā)育軌跡，進(jìn)行了scRNA-seq以分析不同發(fā)育階段的人和猴 細胞的轉錄組。胚胎分離后，使用熒光顯微鏡手動(dòng)收集單個(gè)人類(lèi)（TD+）和猴（TD-）細胞并 進(jìn)行scRNA-seq。對離體培養過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)從嵌合胚胎中分離的227個(gè)人的和302個(gè)食蟹猴 的細胞進(jìn)行了測序（d.p.f.9-d.p.f.17）。TD表達和比對到人類(lèi)或食蟹猴基因組的reads用于進(jìn)一步確認每個(gè)細胞的來(lái)源物種（圖 S2A 和 S2B）。嚴格過(guò)濾后，200 個(gè)人的和 272 個(gè)食蟹猴的細 胞用于進(jìn)一步分析。每個(gè)細胞平均檢測到 9,798 個(gè)基因（每百萬(wàn)轉錄本【TPM】>0）和 27,936,953條reads，在人和猴細胞之間檢測到的基因數量和reads沒(méi)有統計學(xué)差異（圖 S2C）。 為進(jìn)行比較，本分析中還選擇了已發(fā)表的食蟹猴和人類(lèi)胚胎細胞的scRNA-seq數據集 （Nakamura et al., 2016; Niu et al., 2019; Xiang et al., 2020; Zhou et al., 2019）。為避免不同數據 集的批次影響，本研究使用“錨定”方法去除批次效應（Stuart et al., 2019）（圖 S2C）。

圖S2 細胞物種來(lái)源鑒定和QC

對scRNA-seq數據進(jìn)行了t-SNE分析，確定了所有樣本（嵌合胚胎和對照胚胎）中存在4個(gè) 主要細胞cluster：EPI、HYP、TE和EXMC（圖 3A、3B和S2D）。通過(guò)細胞特異性marker分 析，發(fā)現人和食蟹猴之間存在保守性（圖 S2E）（Zhou et al.,2019）。嵌合胚胎中這些細胞類(lèi) 型的存在表明宿主胚胎的發(fā)育基本上不受注射的hEPSCs的影響（Ma et al., 2019; Niu et al.,?2019）（圖 1B 和 1D）。系統發(fā)育樹(shù)分析（基于基因表達水平）顯示，雖然嵌合胚胎中的大 多數食蟹猴細胞分離成不同的細胞類(lèi)型特異性簇（EPI、HYP和TE），但嵌合人類(lèi)HYP-和TE- like 細胞與 EPI-like 細胞聚集在一起（圖 3C）。因此，嵌合食蟹猴細胞比引入的hEPSC表現出 更強的譜系分離。與IF結果一致，在scRNA-seq數據（圖 3A 和 3D）中鑒定到的人類(lèi)TE-like細 胞很少，因此被排除在后續分析之外。這些結果表明，hEPSCs在被引入食蟹猴早期囊胚并進(jìn) 行離體胚胎培養后，可以分化為幾種植入前和植入后早期細胞類(lèi)型。

圖3 人猴嵌合胚胎的單細胞轉錄圖譜

4、hEPSCs在人猴嵌合體發(fā)育過(guò)程中的轉錄組動(dòng)力學(xué)

首先基于所有細胞的轉錄組學(xué)特性構建了一個(gè)導向圖（SPRING）（Weinreb et al., 2018），所有細胞分為三個(gè)分支：EPI、HYP和TE（圖 4A），明確了嵌合體和對照（人和食 蟹猴）胚胎之間基因表達模式的相關(guān)性（圖 4B）。當嵌合人類(lèi)細胞與對照人類(lèi)（0.460）或對 照食蟹猴（0.459）細胞進(jìn)行比較時(shí)，獲得了類(lèi)似的相關(guān)系數（圖 4B，右圖），但與對照胚胎 相比，嵌合猴細胞的相關(guān)系數高于嵌合人類(lèi)細胞（圖 4B，左圖）；接下來(lái)發(fā)現嵌合人EPI-like 細胞與人胚胎中的EPI細胞相似，而嵌合人HYP和EXMC-like細胞分別與嵌合猴HYP和EXMCs 細胞相關(guān)系數最高（圖 4C）。同時(shí)發(fā)現嵌合人類(lèi)EPI-like細胞逐漸傾向于嵌合猴EPI細胞，R2 值從0.363（植入前EPI [Pre_EPI]）增加到0.464（植入后EPI [PostL_EPI]），再增加到0.693 （原腸[Gast]細胞）（圖 4C）。以上結果表明猴胚胎微環(huán)境對人類(lèi)細胞的基因轉錄狀態(tài)產(chǎn)生影 響，反之亦然。

圖4 嵌合胚胎的發(fā)育軌跡

由于食蟹猴的細胞在人類(lèi)細胞存在下表現出轉錄組的變化，接下來(lái)分析了嵌合胚胎中食蟹 猴細胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)。首先確定了嵌合猴胚胎和對照猴胚胎之間的差異表達基因（DEG）。EPI 細胞、HYP細胞和EXMCs細胞與對照胚胎相比，嵌合體細胞中分別有424、7和241個(gè)基因下 調，5、2 和13個(gè)基因上調（圖 4D 和 S3A）。GO和KEGG富集分析確定了在嵌合猴EPI細胞、 HYP細胞和EXMCs細胞中上調和下調基因的信號通路，如Hippo和轉化生長(cháng)因子β（TGF-β） 信號通路分別在嵌合猴EPI細胞和EXMCs細胞中下調（圖 4E）。 已經(jīng)證明食蟹猴EPI細胞的轉錄組譜在嵌合胚胎中發(fā)生了改變，接下來(lái)研究了食蟹猴EPI胚 胎生態(tài)位是否也受到人類(lèi)細胞的影響。CellPhoneDB（v2.0.1）（Vento-Tormo et al., 2018）可 鑒定嵌合胚胎和對照胚胎中EPI和其他譜系（HYP 和 EXMCs）之間細胞的潛在相互作用。結果發(fā)現與對照胚胎相比，嵌合胚胎中有更多的配體-受體相互作用（如，在猴EPI細胞中檢測到 117個(gè) [嵌合] 與10個(gè) [對照] 特異性配體-受體相互作用）（圖 4F 和 S3B）。進(jìn)行KEGG分析發(fā) 現，嵌合胚胎中被加強的信號通路包括磷脂酰肌醇 3-激酶 [PI3K]-Akt、絲裂原活化蛋白激酶 [MAPK] 信號通路和WNT信號通路（圖 4G）。使用相同的方法，還確定了嵌合胚胎內人和猴 細胞-細胞的相互作用，如FGF5-FGFR4、NOTCH4-JAG2、WNT2B-FZD4、WISP3-SORL1和 PLXNB2- PTN（圖 S3C 和 S3D）。結果表明，嵌合胚胎內的細胞間相互作用得到加強，并可 能導致其他信號通路的激活。

圖S3 嵌合胚胎與宿主胚胎食蟹猴細胞對比分析

5、嵌合的人類(lèi)EPI-like細胞顯示出獨特的發(fā)育軌跡

EPI發(fā)展的特點(diǎn)是進(jìn)行多能性轉變，可能在物種之間表現出不同的動(dòng)態(tài)。適當的EPI分化對 于嵌合體的形成和發(fā)育至關(guān)重要，本研究對嵌合胚胎內人類(lèi)EPI-like細胞的譜系分化進(jìn)行了研 究，并將其與體外培養的人類(lèi)和食蟹猴胚胎的數據集進(jìn)行了比較（Nakamura et al., 2016; Niu et al., 2019; Zhou et al., 2019），結果人類(lèi)EPI-like細胞在植入前、植入后和原腸胚形成階段被鑒定，并且在每個(gè)階段表達不同的標記物（圖 5A 和 S4A-S4C），?；鶊D也顯示了相同的人類(lèi)EPI- like細胞發(fā)育軌跡（圖 S4D）。接下來(lái)觀(guān)察到hEPSCs更類(lèi)似于早期PostE_EPI和PostL_EPI細胞。 嵌合體中人PostL_EPI-like細胞與制備的PSC的相關(guān)性高于naive PSC（圖 S4E）。為了進(jìn)一步研 究 hEPSC（Yang et al., 2017b）、嵌合體人類(lèi) EPI-like細胞和宿主猴EPI細胞的轉錄動(dòng)力學(xué)，本研 究進(jìn)行了RNA速度（La Manno et al., 2018）和Slingshot分析（Street et al., 2018）（圖 5B），結 果發(fā)現兩種不同的RNA速度向量模式：嵌合體人類(lèi)PostL_EPI-like細胞向量較長(cháng)，而原腸胚細胞 向量較短；宿主猴PostL_EPI細胞缺乏長(cháng)向量，而原腸細胞具有長(cháng)向量（圖 5B，左邊兩張 圖）。這些結果表明嵌合人類(lèi)EPI-like細胞的發(fā)育延遲。Slingshot分析顯示，hEPSCs在注入食蟹 猴囊胚后，是從EPSCs到PostL_EPI再到原腸胚的發(fā)育軌跡（圖 5B，右圖）。為了進(jìn)一步描繪嵌 合人類(lèi)EPI-like細胞的發(fā)育軌跡，將所有與EPI相關(guān)的人類(lèi)和猴子reads映射到一個(gè)共有基因組， 并使用先前報道的方法（Kanton et al., 2019）預測物種之間EPI的發(fā)育軌跡，與RNA速度分析一 致，發(fā)現嵌合人類(lèi)EPI-like細胞比來(lái)自宿主猴、對照猴和人類(lèi)胚胎的EPI細胞分化得更慢（圖 5C）。這些結果表明，hEPSCs向EPI譜系的特化和/或分化效率低于胚胎細胞。

圖5 食蟹猴胚胎中嵌合人EPI-like細胞的發(fā)育軌跡

為了進(jìn)一步描繪嵌合體人類(lèi)EPI-like細胞發(fā)育的潛在過(guò)程，本研究繪制了嵌合胚胎內的人類(lèi) EPI-like細胞和食蟹猴EPI細胞、對照人和猴胚胎的EPI細胞之間的DEG維恩圖，發(fā)現嵌合體人 EPI-like細胞和來(lái)自對照猴胚胎的EPI細胞之間交集基因315個(gè)（圖 5D），對這些基因進(jìn)行KEGG 分析，確定了PI3K-Akt、MAPK和過(guò)氧化物酶增殖激活受體（PPAR）信號通路，表明它們可能 參與人類(lèi)EPI-like細胞向食蟹猴EPI細胞的轉移過(guò)程（圖 5E和5F）。同時(shí)還發(fā)現了許多可能在調 節嵌合體人類(lèi)EPI-like細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因，如CHD2、POLR2A和RB1（圖 S5A 和 S5B）。此外，還發(fā)現大多數嵌合體人類(lèi)EPI-like細胞表達S/G2/M細胞周期相關(guān)基因，而嵌合 體和對照人、猴胚胎細胞凋亡相關(guān)的基因表達水平無(wú)顯著(zhù)差異（圖 S5C 和 S5E）。Pre_EPI、 PostL_EPI和原腸胚形成細胞中DEG的GO分析顯示嵌合體人類(lèi)EPI-like細胞比正常細胞分化慢 （圖 S5D）。這些分析揭示了驅動(dòng)食蟹猴胚胎內嵌合體中人EPI-like細胞的不同譜系分化動(dòng)力學(xué) 相關(guān)的信號通路和因素。

圖S5 嵌合體EPI細胞的調控網(wǎng)絡(luò )分析

結論

本研究結果初步證實(shí)了胚胎發(fā)育早期人類(lèi)和猴細胞混合時(shí)發(fā)生的細胞和分子事件，結果揭示了靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物胚胎發(fā)生過(guò)程中的進(jìn)化趨同和發(fā)散的過(guò)程。這一系列基礎研究將有助于改善進(jìn) 化距離更遠的物種的人類(lèi)嵌合現象，出于各種原因，包括社會(huì )、經(jīng)濟和倫理，這些物種可能更 適合再生醫學(xué)轉化療法。

本研究局限及后續研究方向

盡管本研究中使用了相對大量的食蟹猴胚胎（132），但由于嵌合體實(shí)驗固有的隨機性，并 考慮到可能影響種間嵌合現象的所有因素，后續需要更大食蟹猴胚胎的數量進(jìn)行擴展分析。因 此本研究的局限性：（1）只測試了猴胚胎中hEPSC的嵌合能力，沒(méi)有研究人類(lèi)或其他物種的其 他多能干細胞，（2）沒(méi)有測試不同hEPSC數量對食蟹猴胚胎的影響，以及（3）無(wú)法測試不同 的注射階段。因此后續可針對本研究的不足，設計更大樣本量、更多多能干細胞種類(lèi)以及探究 不同多能干細胞數量對嵌合體胚胎的影響，為實(shí)現再生醫學(xué)轉化提供更多理論基礎。