在中心法則中，RNA處于重要的中央樞紐地位，轉錄組作為生信科研中的“萬(wàn)金油”，幾乎可以與所有的組學(xué)產(chǎn)品聯(lián)合分析。轉錄組代表了基因表達的中間狀態(tài)，可以反映諸如轉錄調控、轉錄后調控的機理；蛋白組代表生物體直接功能執行狀態(tài)，可以反應轉錄本真實(shí)的表達情況；而代謝組可以反映生物體表型的狀態(tài)變化。轉錄組+蛋白組+代謝組的多組學(xué)分析可以同時(shí)實(shí)現從“因”和“果”兩個(gè)層面來(lái)探究生物學(xué)問(wèn)題，相互間進(jìn)行驗證，從海量的數據中篩選出關(guān)鍵基因、蛋白質(zhì)及代謝通路，解釋生物過(guò)程的復雜性和整體性，提高文章的水平。今天小編通過(guò)一篇案例的解析，帶領(lǐng)大家進(jìn)入多組學(xué)聯(lián)合分析的新視野。
英文題目：Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Decline under High Nitrogen Conditions
中文題目：多組學(xué)聯(lián)合分析揭示了高氮條件下蘋(píng)果果實(shí)品質(zhì)下降的新見(jiàn)解
發(fā)表期刊：Journal of agricultural and food chemistry
影響因子：5.279
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33945277/
研究背景
水果質(zhì)量是消費者偏好的最重要指標，包括各種質(zhì)量特征，如水果顏色、甜度、風(fēng)味和健康價(jià)值。水果的甜度取決于各種糖和糖醇的濃度和組成。此外，次生代謝產(chǎn)物，特別是黃酮類(lèi)化合物，被認為是人類(lèi)日常消費的重要物質(zhì)，可以降低癌癥和心血管疾病的風(fēng)險。
在中國，過(guò)量施用氮肥已成為一種普遍現象，蘋(píng)果樹(shù)種植中施氮量已達600?800 kg/hm2，遠遠超過(guò)蘋(píng)果樹(shù)的需求。雖然高氮對提高產(chǎn)量和單果重有積極作用，但過(guò)量的氮會(huì )影響C?N平衡，對可溶性糖、類(lèi)黃酮等果實(shí)品質(zhì)指標產(chǎn)生負面影響。以往的研究主要集中在氮脅迫對蘋(píng)果葉片的影響上，而高氮對蘋(píng)果果實(shí)初級代謝和次級代謝影響的研究相對較少。本研究通過(guò)轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和廣靶代謝組學(xué)的聯(lián)合分析，探索過(guò)量氮營(yíng)養與初級和次級代謝物積累之間的關(guān)系，特別是C-N平衡中碳水化合物、氨基酸和黃酮類(lèi)化合物的變化，并為提高蘋(píng)果果實(shí)品質(zhì)提供新的見(jiàn)解。
材料方法
實(shí)驗材料：紅富士蘋(píng)果（7齡；中國東北部山東省煙臺市）。對照組CK：正常尿素處理組（300 kg N/hm2，每棵樹(shù)435 g尿素）；實(shí)驗組MHN：中高氮處理組（600 kg N/hm2，每棵樹(shù)870 g尿素）；實(shí)驗組HN：高氮處理組（800 kg N/hm2，每棵樹(shù)1160 g尿素）。在開(kāi)花后183天進(jìn)行13C標記。
理化指標測定：氮含量（凱氏定氮法）；15N和13C豐度（DELTAV advantage同位素比值質(zhì)譜儀）；Ndff和13C分布率；可溶性固形物（糖量計）和可溶性糖的含量（蒽酮比色法）；總游離氨基酸（茚三酮比色法）和可溶性蛋白質(zhì)含量（Bradford法）。
組學(xué)研究：RNA-seq；TMT標記定量蛋白質(zhì)組；廣靶代謝組
主要結果與分析
1. 生理分析
Ndff是指各器官從肥料中吸收的15N相對于各器官總N的貢獻率，它反映了各器官吸收和調節15N的能力。與對照相比，MHN和HN使果實(shí)、一年生枝條和葉片的Ndff值增加，并隨施氮量的增加而增加（圖1A），表明了果實(shí)對15N的吸收和調節最大，MHN和HN提高了新生器官對15N的吸收和調節能力。與對照相比，MHN和HN降低了果實(shí)的13C分布率，增加了營(yíng)養器官（一年生枝和葉）的13C分布率（圖1B），且MHN和HN果實(shí)中15N積累增加，而13C的積累減少。因此，MHN和HN提高了果實(shí)對15N的吸收和調節能力，減少了13C從營(yíng)養器官向果實(shí)的分配。另外，MHN和HN使果實(shí)可溶性糖和總黃酮含量分別降低16.05%和19.01%（圖1I，J），表明高氮條件下蘋(píng)果果實(shí)品質(zhì)惡化。此外，與對照相比，MHN和HN增加了總游離氨基酸（圖1K）和可溶性蛋白質(zhì)（圖1L）的含量。CK和HN果實(shí)生理指標上不存在顯著(zhù)差異，因此選擇這兩個(gè)處理的果實(shí)樣品進(jìn)行后續的組學(xué)研究。
圖1 蘋(píng)果生理指標
2. 轉錄組分析
結果顯示204個(gè)基因上調，545個(gè)基因下調，KEGG分析顯示差異基因（DEGs）主要參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和其他次級代謝產(chǎn)物的生物合成（圖2B）。此外，共鑒定出91種轉錄因子（TF），涵蓋26個(gè)TF家族（圖2C）?？偟膩?lái)說(shuō)，大多數TF在高氮水平下下調。AP2-EREBP、MYB和bHLH是相對較大的TF家族。結果表明，這些顯著(zhù)變化的TFs在高氮脅迫下起著(zhù)重要作用。
圖2 轉錄組學(xué)分析
3. 蛋白質(zhì)組分析
共獲得5340個(gè)蛋白質(zhì)，與對照相比，795個(gè)DEPs在HN中顯示出顯著(zhù)變化，其中422個(gè)蛋白上調，373個(gè)蛋白下調。GO富集分析顯示氧化作用?還原過(guò)程和應激反應富含更多的蛋白質(zhì)，而下調的蛋白質(zhì)富集程度更高（圖3A）。KEGG分析發(fā)現C代謝、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸（TCA）循環(huán)、次級代謝產(chǎn)物生物合成和氨基酸生物合成途徑顯著(zhù)富集（圖3B）。MapMan分析結果顯示許多DEP參與主要和次要CHO代謝、糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸代謝和次級代謝，并且大多數這些蛋白質(zhì)被發(fā)現下調（圖3C）。
圖3 蛋白組分析
4. 廣靶代謝組學(xué)分析
共鑒定到36個(gè)上調代謝物和47個(gè)下調代謝產(chǎn)物（圖4B），包括類(lèi)黃酮，碳水化合物、氨基酸和衍生物等（圖4C）。KEGG富集分析表明差異代謝物（DAMs）主要在氨基酸生物合成、次生代謝產(chǎn)物生物合成、C代謝和類(lèi)黃酮生物合成富集。碳水化合物中D-果糖6-磷酸和Dglucono-1,5-內酯的下調倍數最大，氨基酸和衍生物中，有四種下調，六種上調，其中高精氨酸的上調倍數最大。此外，結果還表明果實(shí)中積累的黃酮類(lèi)化合物較少，且氮含量較高，尤其是鼠李素-3-O-蘆丁苷和蘆丁。
圖4 HN與CK的代謝組學(xué)分析
5. 初級代謝的聯(lián)合分析
C代謝包括淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和TCA循環(huán)。高氮總體下調了C代謝中蛋白質(zhì)（Susy、scrK和HK）的豐度和碳水化合物（蔗糖、葡萄糖和海藻糖）的積累。相反，糖酵解中間產(chǎn)物卻明顯積累，如甘油-P、甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸。這表明蛋白質(zhì)（ALDO、gapN和ENO）與這些中間代謝物之間存在負相關(guān)。糖酵解亞型的增加表明，高氮加速了C在呼吸途徑中的流動(dòng)。氨基酸與碳代謝密切相關(guān)，是氮分配的主要形式。氨基酸生物合成途徑中的大多數蛋白質(zhì)表達下調（脊索酸變位酶除外），而大多數氨基酸及其中間產(chǎn)物表達上調（圖5）。以前的研究表明，隨著(zhù)氮供應的增加，非結構性碳水化合物中的一部分C被并入氨基酸和蛋白質(zhì)中。以氨基酸形式的氮增加，使氮儲存更具成本效益。因此，C向N代謝的轉移是導致高氮條件下碳水化合物減少的一個(gè)重要因素，這使得水果中氨基酸和總氮含量的顯著(zhù)增加。甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸的增加是氨基酸生物合成所需C骨架增加的重要指標。
圖5 C代謝和氨基酸生物合成途徑
6. 次級代謝聯(lián)合分析
參與苯丙烷生物合成途徑的蛋白質(zhì)（4CL、CCR、C3′H和UGT72E）下調，下游代謝物東莨菪堿也顯示下調趨勢。相反，苯丙烷代謝的另一個(gè)分支的代謝產(chǎn)物（松柏醛和松柏醇）顯著(zhù)上調，這可能是由于苯丙烷途徑分支之間的代謝通量重新定向，以應對高氮脅迫并維持苯丙烷代謝的動(dòng)態(tài)平衡。黃酮類(lèi)化合物來(lái)源于苯丙烷代謝途徑，由C代謝誘導。參與類(lèi)黃酮生物合成的基因（CCR、TCEA、F3H、DFR、ANS、BZ1和CYP75B1）和蛋白質(zhì)（PGT1、F3H和ANR）表達下調。類(lèi)似地，參與類(lèi)黃酮生物合成途徑的代謝物（根皮素、劍麻素、橙皮素-7-葡萄糖苷、三葉草素、槲皮苷、蘆丁等）顯示出下調趨勢，其中，蘆丁的表達下調幅度最大（圖6）。在類(lèi)黃酮生物合成途徑中，發(fā)現許多TF可調節結構基因的表達。此外，在高氮條件下，C在初級和次級代謝中的分布可能是類(lèi)黃酮生物合成下降的原因。
圖6 苯丙素和類(lèi)黃酮的生物合成途徑
7. 共表達網(wǎng)絡(luò )分析
基于Pearson相關(guān)分析（系數>0.9，P<0.05），篩選與初級代謝和次級代謝相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)和代謝物（圖7）。獲得5個(gè)hub基因和3個(gè)hub蛋白，其中MD07G1172700（編碼PAL）包含在次級代謝中，MD05G1222800（編碼argD）、MD16G1227200（編碼leuC）、MD01G1174400（編碼GLUD1_2）、MD02G1207200（編碼tktA）、PFK、gapN，而HK則包含在初級代謝中。這些hub基因和蛋白質(zhì)之間存在著(zhù)相對較多的正相關(guān)節點(diǎn)。
圖7 參與初級和次級代謝途徑的基因、蛋白質(zhì)和代謝物的共表達網(wǎng)絡(luò )
總結
高氮增加了果實(shí)對15N的吸收和調節能力，降低了C在果實(shí)中的分配率，從而導致蘋(píng)果果實(shí)的總N增加，總C和C/N比率降低。高氮破壞了蘋(píng)果C?N平衡，降低了蘋(píng)果果實(shí)的可溶性糖和總黃酮含量，進(jìn)而使果實(shí)品質(zhì)惡化?；诙嘟M學(xué)分析，揭示了高氮對初級代謝和次級代謝互作網(wǎng)絡(luò )。高氮調節了蘋(píng)果果實(shí)中基因和蛋白質(zhì)的表達，抑制了碳水化合物和黃酮類(lèi)化合物的積累，更多的碳骨架被用來(lái)合成氨基酸及其衍生物并轉移到氮代謝中。本研究揭示了高氮導致蘋(píng)果果實(shí)糖和類(lèi)黃酮含量下降的機理，并獲得了關(guān)鍵候選基因和蛋白質(zhì)。
參考文獻
Wang F , Ge S , Xu X , et al. Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Quality Decline under High Nitrogen Conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(19).
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