Nanopore全長(cháng)轉錄組由于其長(cháng)讀長(cháng)、低堿基偏好性，同時(shí)完成基因水平及轉錄本水平定量的高性?xún)r(jià)比的優(yōu)勢，越來(lái)越多的應用于新轉錄本發(fā)現、可變剪接發(fā)現、轉錄本水平定量等方向的研究，目前已經(jīng)產(chǎn)出多篇高分文章。今天和大家一起分享一篇Nanopore全長(cháng)轉錄組測序技術(shù)在中醫藥領(lǐng)域上應用研究的文章。
英文題目：Full-length transcriptome analysis reveals the mechanism of acupuncture at PC6 improves cardiac function in myocardial ischemia model
發(fā)表期刊：Chinese Medicine
影響因子：5.455
發(fā)表單位：成都中醫藥大學(xué)
原文鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34238326
研究背景
心肌缺血(MI)是一種嚴重的心血管疾病，具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)。心肌缺血的病理過(guò)程非常復雜。針刺內觀(guān)穴（PC6）已被證實(shí)對心肌梗死有效，但其機制尚不清楚。本研究通過(guò)全長(cháng)轉錄組研究了針刺對心肌梗死影響的機制，本研究將有助于為心肌梗死尋找新的治療靶點(diǎn)，為針刺研究提供獨特的視角。
材料方法
成年雄性C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組、MI組和PC6組。MI組小鼠為通過(guò)結扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)形成MI模型，PC6組在造模完成后，針刺內關(guān)穴治療5天后取材。經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖評估MI手術(shù)前后小鼠心功能情況，并進(jìn)行血清心肌酶和炎癥細胞因子的測定，之后三組樣本各取3個(gè)重復，共9個(gè)樣本進(jìn)行ONT全長(cháng)轉錄組測序。
主要結果
一、針刺PC6穴位可有效保護心肌免受MI損傷
為了探討針刺PC6穴對心肌損傷的影響，作者首先評估了心功能和梗死面積。超聲心動(dòng)圖結果顯示MI組的EF（ejection fraction）和FS（fractional shortening）均較對照組明顯降低。PC6穴位治療后，EF和FS均增加。針刺治療5天后, 采用TTC染色檢測梗死面積。結果顯示，針刺治療顯著(zhù)減小心肌損傷的大小。采用ELISA法測定反映急性心肌損傷的心肌特異性血清酶，包括心肌肌鈣蛋白T (cTnT)和心肌肌鈣蛋白I (cTnI)的水平。結果表明，心肌梗死術(shù)后cTnT和cTnI水平升高，針刺可顯著(zhù)降低血清酶水平。
二、針刺PC6穴位廣泛改變基因表達
為了探討針刺治療心肌梗死的機制，作者利用納米孔完成了不同組的基因表達檢測。RNA-seq結果顯示，與對照組相比，MI組有5083個(gè)差異表達基因，PC6組與MI組相比有324個(gè)差異表達基因。通過(guò)聚類(lèi)分析將對照組、MI組和PC6組中上調和下調基因制作熱圖和維恩圖，發(fā)現MI組2773個(gè)差異基因上調，針刺治療下調了其中的65個(gè)差異基因，同時(shí)，在MI組的2308個(gè)下調的差異基因中，針刺治療可逆轉19個(gè)差異基因的表達。作者推測這84個(gè)差異基因可能是針刺抗心肌缺血作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)?；赟TRING數據庫對MI和PC6共同調控的差異基因進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò )分析。結果表明，蛋白質(zhì)主要富集了4類(lèi)，主要包括：炎癥反應，肌動(dòng)蛋白細胞骨架的調節，I型干擾素介導的信號通路，以及RNA聚合酶II基因DNA在核外周的轉錄依賴(lài)鏈。
三、炎癥反應的驗證
差異基因主要富集在炎癥反應信號通路中，通過(guò)HE染色顯示MI組炎性細胞大量積聚，針刺可明顯減少炎性細胞浸潤。檢測血清中炎性細胞因子的水平顯示MI組血清TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IL-1β(白細胞介素-1β)、IL-6(白細胞介素-6)水平較對照組升高，針刺可降低這些炎性細胞因子水平，并通過(guò)PCR進(jìn)行了驗證。
四、整合心肌缺血的可變剪接事件
已有研究報道可變剪接（AS）參與心肌缺血的發(fā)生發(fā)展。作者在每組中發(fā)現了大量的AS。在所有RNA-seq檢測的樣本中，共發(fā)現與1994個(gè)基因相關(guān)的8237個(gè)AS事件。并對不同類(lèi)型的可變剪接時(shí)間進(jìn)行了統計，結果表明，一個(gè)基因可能發(fā)生多種類(lèi)型的mRNA剪接事件;部分基因可能有3種AS類(lèi)型表達，半數以上的AS事件是ES類(lèi)型的事件。差異表達基因和AS事件相關(guān)基因分析結果顯示許多差異基因經(jīng)歷了AS事件，表明許多基因可能在MI的病理過(guò)程和針刺選擇性剪接治療中發(fā)揮作用。KEGG富集分析結果發(fā)現AS相關(guān)基因主要富集在線(xiàn)粒體組織、蛋白酶體蛋白分解代謝過(guò)程、RNA剪接、通過(guò)剪接體剪接mRNA以及代謝過(guò)程等途徑。
五、心肌缺血的差異選擇性剪接事件分析
差異AS分析結果顯示，本研究共鑒定出347個(gè)差異AS事件，其中上調174個(gè)，下調173個(gè)。AS上調事件數量與AS下調事件數量相同。與對照組相比，MI組有129例AS事件差異上調，147例AS事件差異下調。與MI組相比，PC6組有45個(gè)AS事件差異上調，26個(gè)AS事件差異下調。通過(guò)GO和KEGG富集分析，作者發(fā)現這些基因富集的前10個(gè)通路包括核糖體、HIF-1信號通路、肥厚型心肌病、擴張型心肌病。結果表明，這些參與差異AS事件的基因與心臟病有關(guān)。
六、在全長(cháng)轉錄組中檢測到的新基因的分析
全長(cháng)轉錄組可以準確識別轉錄本結構從而鑒定新轉錄本。本研究中一共鑒定到了602個(gè)新基因。這些新基因大部分為9個(gè)樣本共享，說(shuō)明這些新基因可以在所有樣本中穩定表達。也有一些新的基因僅在MI組和PC6組表達，說(shuō)明在病理條件下這些基因表達模式發(fā)生了變化（圖B)。對照組新基因表達模式與MI組和PC6組差異顯著(zhù);而MI組與PC6組有相似的新基因表達模式。維恩圖分析差異新基因的重疊部分，結果發(fā)現MI組3個(gè)上調基因在針刺后下調，只有1個(gè)下調的新基因通過(guò)針刺表達上調。
總結
作者證明針刺PC6可以改善心功能，減少梗死損傷。通過(guò)ONT全長(cháng)轉錄組準確的鑒定出的轉錄本結構信息，作者發(fā)現針刺可以調節差異表達基因和可變剪接，并預測這可能會(huì )影響蛋白質(zhì)的結構和功能。作者還檢測到針刺治療后表達發(fā)生變化的4個(gè)新的基因，這些基因可能是針刺治療心肌梗死的靶點(diǎn)?；谶@些結果，作者得到針刺治療心肌缺血可能是通過(guò)轉錄組的多方面調控的結論。
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