2021年7月2日，上海交通大學(xué)醫學(xué)院與北京百邁客生物科技有限公司合作的文章發(fā)表在NEURO-ONCOLOGY（IF 12.3）上，研究團隊利用RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C檢測技術(shù)，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點(diǎn)，此外，本研究還發(fā)現鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。以下是對該文章的詳細解讀。
導讀
脊索瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)惡性腫瘤，復發(fā)率高，致瘤機制不明確。遺傳物質(zhì)的改變、表觀(guān)遺傳調節因子和染色質(zhì)空間構象在脊索瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)對脊索瘤和人髓核（HNP）進(jìn)行多組學(xué)檢測，并結合影像學(xué)檢查和臨床信息，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤中的重要作用，并且發(fā)現CA2在脊索瘤中高表達，但在HNP中幾乎不表達。本研究還發(fā)現可通過(guò)敲除基因或使用鹽酸多佐胺等藥物抑制CA2的表達，從而抑制脊索瘤細胞生長(cháng)和遷移，此外，鹽酸多佐胺還通過(guò)阻斷骨髓單核細胞向破骨細胞的分化來(lái)調節骨微環(huán)境。綜上，本研究通過(guò)結合多組學(xué)檢測技術(shù)，最終揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點(diǎn)， 此外，本研究還發(fā)現鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。
研究背景
脊索瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)惡性腫瘤，主要發(fā)生在中軸骨，如顱底蝶枕部和骶尾部。在治療上，常規劑量的放療和化療對它沒(méi)有作用，因此手術(shù)是主要治療方法 ，但其復雜的解剖結構和相對較大的腫瘤體積使得腫瘤組織不能被切除干凈，導致局部復發(fā)率高。因此，迫切需要探索脊索瘤潛在的致瘤機制和治療新靶點(diǎn)。
在病理學(xué)上，脊索瘤起源于椎體內的脊索殘留物，由胚胎晚期不完全擠壓引起。脊索瘤的發(fā)生涉及到幾個(gè)基因的異常表達，例如TBXT、CDKN2A和LYST。除了基因表達改變外，染色質(zhì)可及性的改變，以及染色體構象的改變，如通過(guò)染色質(zhì)折疊將線(xiàn)性距離較遠的啟動(dòng)子、增強子和其他順式調控區域聚集在一起等，這些改變對基因的調控也至關(guān)重要。
本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)在脊索瘤和脊索來(lái)源的髓核中綜合分析了基因表達情況和染色質(zhì)可及性，結果表明骨微環(huán)境和骨骼系統發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的潛在作用。此外，通過(guò)比較差異表達基因（DEG），發(fā)現CA2在脊索瘤中高表達，其抑制劑鹽酸多佐胺可靶向作用于CA2，從而抑制脊索瘤細胞增殖、遷移、致瘤性和破骨細胞分化。
實(shí)驗方法
材料：細胞系（原代HNP細胞來(lái)自24周胎齡的流產(chǎn)胎兒的原代培養細胞；脊索瘤細胞系CH22獲自脊索瘤基金會(huì )；骨髓單核細胞（BMM）來(lái)自C57/BL6小鼠股骨）
方法：RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C
研究結果
1、HNP和CH22細胞的差異基因分析（DEG）
對CH22和HNP細胞的轉錄組數據進(jìn)行比較分析，每種細胞類(lèi)型內的重復間具有高度相關(guān)性（r2=0.9937 和 r2=0.9841）。與HNP相比，在CH22中鑒定了3,122個(gè)上調的基因和1,810個(gè)下調的基因，熱圖和火山圖顯示了幾個(gè)重要的DEG，例如GDA、TBXT、CDKN2A和CDKN2B（圖1A、B）。GO分析顯示DEG與軸突發(fā)育和骨骼系統發(fā)育相關(guān)（圖1C）；KEGG富集分析發(fā)現，PI3K-AKT和MAPK信號通路在脊索瘤腫瘤發(fā)生中富集。
圖1 RNA-seq和ATAC-seq數據分析
2、HNP和CH22細胞的染色質(zhì)差異可接近性區域分析（DAR）
與HNP相比，在CH22中確定了313個(gè)增加的DAR 和 1,749 個(gè)減少的DAR。DAR的motif分析顯示CTCF、Nkx2-2、Tcfe2a_2、MED-1 和 E2A motif在CH22中高度富集。還確定了DAR中的DEG，如GDA、TBXT和PAX1（圖 1D）。GO分析顯示DAR中的基因與骨骼系統發(fā)育有關(guān)（圖 1E）；KEGG富集分析顯示這些基因富集在PI3K-AKT信號通路上。
3、HNP與CH22細胞間染色體相互作用差異
對CH22和HNP進(jìn)行Hi-C染色體構象捕獲測序，共獲得1027和8.64億個(gè)有效相互作用對。相互作用類(lèi)型分析顯示，HNP和CH22的平均順?lè )幢确謩e為1.815和0.69，表明CH22中的染色體間相互作用更強。
染色體相互作用頻率（IR）能夠反映基因組區域在細胞核中的相對位置，與轉錄活性相關(guān)。在HNP的IR熱圖中，觀(guān)察到在富含基因的短染色體（chr16、17、19-22）中IR較高，尤其是在chr21和chr22之間。在CH22中，chr3和chr15、chr5和chr20、chr2和chr4、chr9和chr13、chr12和chr16之間的IR更高，短染色體（chr16-22）之間的IR更低。IR強度和DEGs/DARs無(wú)顯著(zhù)相關(guān)性（p = 1）。
4、HNP和CH22細胞之間的結構變異
與HNP 相比，在CH22中發(fā)現了一些大的染色體結構變異，表明脊索瘤發(fā)生中會(huì )出現的幾個(gè)染色體易位事件，例如chr2和chr4（圖 2A）。在CH22中鑒定了8個(gè)明顯的結構變異區域，如在Hi-C中觀(guān)察到兩個(gè)明顯的相互作用區域R5（在chr2 R1和Chr4 R3之間）和R6（在chr2 R2和chr4 R4之間）。H2信號表明chr2和chr4之間在P1（chr2：55,540,000）和P3（chr4：156,520,000）位置發(fā)生了相互易位。位置P1和P2 (chr2:160,550,000) 之間的強相互作用信號（H1）表明Chr2中的倒位區域與易位區域相鄰（圖 2B）。此外，還發(fā)現了chr12中更強的染色體內相互作用信號（CNV 區域）（18,040,000-90,120,000bp，圖 2C）和chr9中的缺失區域（21,640,000-25,360,000bp）。在 CNV 區域，有187個(gè)DEG，包括一些普遍報道的與脊索瘤相關(guān)基因，例如KRT8和KRT18（圖 2D），臨床樣本進(jìn)一步證實(shí)了它們在脊索瘤中高表達。在缺失區域，鑒定了9個(gè)DEG，包括腫瘤抑制基因，如CDKN2A和CDKN2B（圖 2E）?；贕O和KEGG分析，發(fā)現CNV區域中的基因與骨骼系統發(fā)育和癌癥中的蛋白聚糖通路相關(guān)（圖 2F）。
圖2 HNP和CH22細胞的結構變異分析
5、HNP和CH22細胞之間的compartments分析
常染色質(zhì)和異染色質(zhì)可分為兩個(gè)區域，定義為compartments“A”和“B”。 脊索瘤A/B compartments的基因組和表觀(guān)遺傳特征表明，compartments A與較高的基因密度、轉錄活躍區域相關(guān)，而compartments B具有較差的基因密度、與轉錄非活躍區有關(guān)。
在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，染色質(zhì)compartments會(huì )進(jìn)行轉換。與HNP相比，CH22的每條染色體中都發(fā)現了compartments轉換，尤其是在chr1、9、13-16和22（圖3A）。HNP中9.99%的compartments A在CH22中為compartments B，6.06%的compartments B在CH22中為compartments A，從A到B的轉換中基因的表達顯著(zhù)下調（p=1.08 e-74 ），反之亦然（p=4.11 e- 47 ）。
進(jìn)一步標記了441個(gè)基因從compartments B切換到compartments A（376 個(gè)下調和 65 個(gè)上調）和341個(gè)基因從compartments A 轉換到compartments B（38 個(gè)下調和 303 個(gè)上調，圖3B、C)。GO和KEGG分析表明它們與骨骼系統發(fā)育和致癌途徑有關(guān)，如癌癥中的PI3K-AKT信號和蛋白聚糖通路。
圖3 細胞特異性compartments、TAD邊界和Loop分析
6、HNP和CH22細胞之間特異TAD邊界分析
compartments由TAD組成，它們在細胞類(lèi)型和物種中是保守的。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，被破壞或新形成的TAD邊界可能導致增強子和啟動(dòng)子之間的相互作用，并調節基因表達。本研究在HNP中檢測到6,677個(gè)TAD，在CH22中檢測到4,856個(gè)TAD。TAD 邊界處基因和染色體開(kāi)放富集區域的富集程度大于TADs內部。
研究確定了1,617個(gè)HNP特異邊界和437個(gè)CH22特異邊界，同時(shí)確定了位于HNP和CH22特異邊界的588和62個(gè)DEG，包括CA3、RAB17和TRIB2（圖3D，E）。GO和KEGG分析表明這些DEG與細胞外基質(zhì)和細胞因子-細胞因子受體相互作用有關(guān)。
7、HNP和CH22細胞之間的特異Loop分析
在基因調控中，增強子通過(guò)染色質(zhì)Loop激活啟動(dòng)子。本研究在HNP和CH22中分別檢測到10,048和12,170個(gè)Loop，中位數長(cháng)度為100,000 bp。通常認為，與增強子相關(guān)的Loop可以增加基因表達。本研究在HNP和CH22中分別鑒定了3,515和4,187個(gè)啟動(dòng)子-增強子loop（圖3F）。其中，ATAC-seq峰分別支持2,495 和1,732個(gè)。此外，在CH22中發(fā)現了比HNP更多的啟動(dòng)子loop和增強子loop。
兩種細胞類(lèi)型中的loop是高度保守的，分別鑒定了1,226個(gè)HNP特異性loop和3,348個(gè)CH22特異性loop（圖 3G）。在HNP特異性loop中，發(fā)現了45個(gè)在CH22中上調表達的基因和41個(gè)在CH22中下調的基因，以及CH22特異性loop中的75個(gè)CH22上調基因和129個(gè)CH22下調基因，例如 GDA、EEF1A2和ADAM12（圖3H)。GO 和 KEGG 分析表明這些DEGs 與軸突發(fā)育、癌癥中的蛋白聚糖通路和 PI3K-AKT 信號通路有關(guān)。
8、HNP與CH22細胞的多組學(xué)聯(lián)合分析
為了探索潛在的治療靶點(diǎn)，本研究結合了位于CH22和HNP細胞之間的compartments、細胞特異性TAD和loop中的重疊的DEG，鑒定到了兩個(gè)重疊的DEG（圖 3I），即CA2和THNSL2?；贕O和KEGG功能注釋?zhuān)l(fā)現骨骼系統發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的重要作用。此外，根據427名脊索瘤患者的影像學(xué)數據，發(fā)現所有脊索瘤均在骨結構中被識別，但并非源自HNP。在四個(gè)外部數據庫中，骨骼是脊索瘤發(fā)生最常見(jiàn)的位置，比例分別為73.98%、79.18%、86.31% 和 86.06%?？偟膩?lái)說(shuō)，在3169例脊索瘤患者中，2439個(gè)脊索瘤位于骨內，410個(gè)位于腦脊髓神經(jīng)系統，159個(gè)位于鼻咽和蝶竇，147個(gè)位于軟組織，6個(gè)位于胸腔，8個(gè)位于不明原發(fā)部位。
研究結論
本研究采用多組學(xué)技術(shù)，對脊索瘤和HNP中的基因表達、染色質(zhì)可及性和染色質(zhì)空間結構進(jìn)行了綜合比較分析，并進(jìn)行了大樣本量驗證。結果不僅證明了骨微環(huán)境與脊索瘤發(fā)生的相關(guān)性，而且還確定了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)（CA2）。此外，研究結果還表明鹽酸多佐胺有望成為脊索瘤的一種潛在治療選擇。
參考文獻
Meng T, Huang R, Jin J, et al. The comparative integrated multi-omics analysis identifies CA2 as a novel target for chordoma. Neuro Oncol. 2021 Jul 2:noab156. doi: 10.1093/neuonc/noab156
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