2019年3月在A(yíng)cta Neuropathologica雜志（IF=15.87）發(fā)表了一篇Loss of DPP6 in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability 文章。簡(jiǎn)單一句話(huà)介紹就是，作者采用二代和三代Nanopore重測序數據找到了DPP6上的4M大小的倒位，并采用二代測序數據大隊列研究DPP6基因的變異對阿爾茲海默癥的影響。
摘要
新出現的證據表明，神經(jīng)退行性腦疾病(NBD)中存在一種匯聚機制，早期神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )功能障礙和神經(jīng)穩態(tài)的改變，這些都是神經(jīng)退行性疾病的罪魁禍首。本研究中，作者采用二代測序和三代長(cháng)read全基因組測序來(lái)研究常染色體顯性遺傳史的癡呆家族顯著(zhù)關(guān)聯(lián)的7q36。他們識別并驗證了4Mb的倒位在疾病單倍型中分離，并擾亂了DPP6基因的編碼序列。在早發(fā)性阿爾茲海默癥和額顳葉癡呆中，利用DPP6基因的重測序技術(shù)識別了更多罕見(jiàn)的非同義突變，移碼突變和無(wú)義突變。
DPP6是一個(gè)II型跨膜蛋白，有著(zhù)高度結構的細胞外的結構域，并且主要在腦中表達。DPP6與鉀通道Kv4.2形成多聚體復合物，調節腦中電壓依賴(lài)性門(mén)控特性。Kv4.2在大腦中的表達在神經(jīng)元興奮性中起關(guān)鍵作用。體外模擬發(fā)現患者的無(wú)義突變會(huì )改變DPP6，并降低薄膜表達進(jìn)而導致蛋白的缺失。在無(wú)義突變攜帶者上可以檢測到DPP6和Kv4.2表達降低。同時(shí)DPP6的缺失會(huì )導致神經(jīng)過(guò)度興奮，敲除Dpp6的小鼠的行為會(huì )發(fā)生改變?？偠灾?，DPP6作為癡呆研究中的新基因，能夠加強神經(jīng)過(guò)度興奮，并能改變神經(jīng)細胞啟動(dòng)的內穩態(tài)。
測序方法
二代重測序：4個(gè)1270患病家族中第三代的子女；
三代重測序：上述4個(gè)樣品中的patient III-48以及10名無(wú)關(guān)癡呆患者和對照組樣品，采用牛津納米孔公司（Oxford?Nanopore?Technologies，簡(jiǎn)稱(chēng)ONT）的高通量測序平臺PromethION測序儀進(jìn)行長(cháng)read基因組測序，首先用Megaruptor 將DNA被打斷成35Kb，并采用BluePippin 選擇最短6kb的片段進(jìn)行文庫制備和測序；
DPP6基因重測序：對558個(gè)早發(fā)性阿爾茲海默癥患者（EOAD，平均發(fā)病年齡61.6±6.8）和614個(gè)額顳葉癡呆患者（FTD，平均發(fā)病年齡66.1±9.9），采用Illumina公司 Miseq測序儀對DPP6基因完整的編碼區域重測序。
分析結果
1270家族的二代測序結果
先前對1270家族的7q36的遺傳分析識別了五個(gè)不同基因（ABCF2, GALNT11, DPP6, PAXIP1, EN2 ）的七個(gè)變異，且在1270家族的疾病單倍型中是分離的。大多數這些變異是同義突變，并且只有PAXIP1 p.A660變異在對照個(gè)體中是缺失的。目前公開(kāi)的基因數據（如ExAc）顯示，PAXIP1存在不同的核苷酸變化，導致同樣的沉默突變（p.A660），這使得PAXIP1不太可能具有有害影響。此外，我們沒(méi)有發(fā)現PAXIP1在患者淋巴母細胞中異常剪接的證據。
對1270家族的第三代4個(gè)患病的兄弟姐妹（III-12，III-38，III-41，III-48）進(jìn)行WGS測序。選擇4個(gè)患者共有的注釋的高質(zhì)量的遺傳變異，罕見(jiàn)的（千人基因組計劃中<1%）或者雜合的非編碼變異進(jìn)行后續研究。在STR標記D7S636和D7S559上連鎖區域的位點(diǎn)保留了79個(gè)非編碼的變異。驗證和分離分析保留了38個(gè)非編碼變異，這些變異在1270家族的疾病單倍型中共分離。對照個(gè)體中的變異的基因型顯示4個(gè)變異對于1270家族是唯一的。其中3個(gè)變異均位于DPP6基因的1號內含子上，另一個(gè)變異位于基因間區（距SHH基因最近，27.3Kb）距離DPP6基因下游908kb。而這四個(gè)變異在ENCODE注釋都不具有潛在的高度破壞性。
注：共分離是指在有性繁殖的后代，假如基因附近有一緊密連鎖的分子標記，在細胞減數分裂時(shí)分子標記與基因之間由于相距太近很少有機會(huì )發(fā)生交換，那么這種分子標記與連鎖的基因有最大的可能同時(shí)出現在同一個(gè)個(gè)體中。
為了排除是連鎖區域外的編碼變異引起的疾病，作者提取了WGS數據的外顯子，并且分析了罕見(jiàn)的及新的編碼非同義變異。選擇四個(gè)患者共有的雜合變異（UTRs，同義和非同義）。只驗證了出現在已知的蛋白編碼基因的罕見(jiàn)或者新的變異。這個(gè)選擇產(chǎn)生了9個(gè)非同義突變，如下表，但卻在1270家族中沒(méi)有與疾病共分離。
連鎖7q36區域存在4Mb的反轉破壞了DPP6序列
作者設計引物擴增連鎖區域去證實(shí)這些變異，結果發(fā)現PCR產(chǎn)物在兩個(gè)7號染色體的位點(diǎn)比對到了相反的方向，且距離將近4Mb。7號染色體上的局部比對，證實(shí)了反向雜合低拷貝重復的出現。遠端的斷點(diǎn)位于7q36.2連鎖區域上，DPP6基因的1號內含子上，被預測改變了基因的編碼序列；臨近的倒位斷點(diǎn)位于連鎖區域之外。
作者對III-48號樣品進(jìn)行三代測序去驗證前面推測的結果。作者采用PromethION測序對III-48號患者進(jìn)行測序，約6X覆蓋度，得到21.2G數據。在七號染色體的149,704,610–153,786,893區域發(fā)現了倒位。而這個(gè)7q36.2倒位（在DPP6基因的1號內含子上存在斷點(diǎn)），卻沒(méi)有在先前的209個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體的二代WGS數據中被發(fā)現。同時(shí)用三代ONT平臺產(chǎn)生的10個(gè)癡呆患者和對照患者也都沒(méi)有出現這個(gè)倒位。
DPP6上的罕見(jiàn)變異與神經(jīng)退行性癡呆相關(guān)
為了更好的理解DPP6對于退行性癡呆(NBD)的遺傳貢獻，作者對558個(gè)早發(fā)性阿爾茲海默癥（EOAD）和614個(gè)額顳葉癡呆患者（FTD）的DPP6編碼外顯子進(jìn)行測序并識別罕見(jiàn)的蛋白改變的變異。在2個(gè)FTD患者中識別到兩個(gè)終止密碼子突變（PTC），p.E79Gfs*9 和p.Q23O* ，且在755個(gè)對照組中是缺失的。此外，在阿爾茲海默癥（AD），FTD及對照組的1號外顯子上識別到了22個(gè)錯義變異以及大小變化的Gly插入/缺失。最后發(fā)現DPP6基因上罕見(jiàn)變異與AD、FTD顯著(zhù)的關(guān)聯(lián)。
罕見(jiàn)變異改變患者腦組織中DPP6表達水平
只有3個(gè)攜帶DPP6無(wú)義突變的患者的解剖大腦被凍存。這三個(gè)患者的神經(jīng)病理學(xué)診斷分別是阿爾茲海默癥AD，FTLD-TDP typeD（FTD行為變異和佩吉特氏骨?。?，FTLD-ALS type B（FTD行為變異及球類(lèi)型）。結果發(fā)現三個(gè)DPP6變異(p.P509R, p.R47L, and p.D596N)?的mRNA表達水平顯著(zhù)下調，并且發(fā)現p.P509R和p.R47L 攜帶者的DPP6蛋白表達水平也顯著(zhù)下降。
參考文獻
Loss of DPP6, in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability[J]. Acta Neuropathologica:1-18.
點(diǎn)擊下方按鈕下載英文文獻原文。
京公網(wǎng)安備 11011302003368號