【項目文章】大豆冷脅迫研究文章解讀

miRNA是一類(lèi)內源性小RNA，長(cháng)度為18-40nt，不編碼蛋白。在植物中以降解mRNA或阻止mRNA翻譯的方式起到重要作用。大多數已知的miRNA都會(huì )參與植物的生長(cháng)發(fā)育過(guò)程，已經(jīng)在擬南芥、楊樹(shù)等植物中鑒定到了一類(lèi)響應冷刺激的miRNA。大豆是一類(lèi)重要的糧食作物，具有很高的營(yíng)養成分。然而，冷脅迫會(huì )直接影響大豆的生長(cháng)發(fā)育并導致產(chǎn)量的減少。今天小R就為大家分享一篇研究大豆冷脅迫下miRNA及其靶基因的作用機制的文章。

實(shí)驗材料

大豆“Taiwan 75”培養在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對照組和處理組。對照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設置3次生物學(xué)重復。

研究結果

1.sRNA測序數據統計
首先，對大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對照組進(jìn)行相對生長(cháng)速率（RGR）和MDA含量的檢測。發(fā)現在24h時(shí)，對照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進(jìn)行sRNA測序。

對照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長(cháng)度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長(cháng)度分布統計可以看出24nt所占比例*高，在對照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長(cháng)度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個(gè)miRNA，屬于133個(gè)家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發(fā)育過(guò)程和響應脅迫上起到重要作用。通過(guò)同源比對鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進(jìn)化。

 

3.預測大豆中新的miRNA
根據miRNAs前體的發(fā)夾結構來(lái)預測miRNAs，找到3個(gè)預測的miRNA并鑒定折疊成的二級結構。

 

4.驗證大豆中預測的miRNA
為了驗證測序結果，利用qRT-PCR分析miRNA表達情況。選擇了35個(gè)miRNA（33個(gè)已知miRNA，2個(gè)預測miRNA）進(jìn)行qRT-PCR分析。線(xiàn)性回歸分析測序結果和qRT-PCR結果相關(guān)性系數為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結果在√確的倍數方面有些差異，這可能是由于2種實(shí)驗結果敏感性和特異性的不同導致的，但是miRNA表達趨勢是一致的。

圖2.qRT-PCR結果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個(gè)轉錄本是54個(gè)miRNA家族的靶基因。本研究發(fā)現miRNAs可以降解2個(gè)甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個(gè)基因，脫落酸響應結合因素蛋白家族和2個(gè)基因，2個(gè)轉錄因子等。而且，有7個(gè)轉錄本受到多個(gè)miRNAs的調控。

 

6.鑒定大豆冷脅迫下相關(guān)的miRNA
對miRNA進(jìn)行差異表達分析，共鑒定到32個(gè)miRNA家族的51個(gè)miRNA差異表達。在冷脅迫下有30個(gè)下調表達，21個(gè)上調表達。

對相應靶基因進(jìn)行功能注釋來(lái)研究差異表達的miRNA可能行使的功能。差異表達的miRNA可以分為四類(lèi)。第一類(lèi)包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因為轉錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調控基因表達和信號傳導。第二類(lèi)包括miR4411，其對應靶基因涉及抵御疾病。第三類(lèi)包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對應靶基因參與植物生長(cháng)發(fā)育中的適應性。為了進(jìn)一步確認冷脅迫下miRNA和靶基因的關(guān)系，選擇了5個(gè)miRNAs及其靶基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。結果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著(zhù)下調。說(shuō)明miRNA和對應靶基因呈負相關(guān)性。

圖3.miRNA和對應靶基因qRT-PCR圖

 

為了近一步確認這些差異表達miRNA的功能，對靶基因進(jìn)行GO分析。靶基因共參與了56個(gè)分子功能terms，37個(gè)生物學(xué)過(guò)程terms和7個(gè)細胞組分terms。在分子功能分類(lèi)下，ATP結合、蛋白結合、組蛋白結合等terms是顯著(zhù)富集的。超過(guò)35%miRNAs的靶基因參與了生物學(xué)過(guò)程途徑。

 

圖4.GO注釋

結 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調控基因表達情況。利用降解組測序鑒定到了上百個(gè)靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關(guān)系。盡管miRNAs調控機制十分復雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數據庫，為研究大豆和其他物種的基因調控網(wǎng)絡(luò )提供了重要基礎。也發(fā)現了51個(gè)響應冷脅迫的miRNAs。

文章亮點(diǎn)
1.處理時(shí)間點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了預實(shí)驗，設置多個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行處理并進(jìn)行生理指標測定，最終選擇變化較為明顯的時(shí)期。選樣時(shí)間點(diǎn)有理有據。
2.利用降解組測序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.