Iso-RNA（ONT）實(shí)驗流程材料方法

 

1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠(chǎng)家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠(chǎng)家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠(chǎng)家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠(chǎng)家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠(chǎng)家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠(chǎng)家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測

2.2判定標準

1)總量≥1（ug），滿(mǎn)足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測6.0-6.4的需結合基線(xiàn)判斷，28S/18S≥1 且基線(xiàn)無(wú)上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1建庫流程

1) 利用帶OligodT的反轉錄引物通過(guò)退火與mRNA的polyA尾結合，然后加入RT逆轉錄酶合成第一鏈

2)使用含barcode的擴增引物擴增成雙鏈cDNA，并為樣品加上barcode

3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復和末端修復加A

4)使用SQK-LSK114試劑盒完成測序接頭的連接

3.2建庫設備

數字 3*32PCR 儀 廠(chǎng)家 Appliedbiosystems 儀器規格 proflex3*32

制冷型程控五段金屬浴 廠(chǎng)家 天根生化 儀器規格 OSE-DB-02

3.3建庫試劑盒

1)PCR條形碼試劑盒 貨號 EXP-PBC096 廠(chǎng)家 Nanopore

2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號 M6630L 廠(chǎng)家 NEB

3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號 E7546L 廠(chǎng)家 NEB

4)連接測序試劑盒 V14 貨號 SQK-LSK114 廠(chǎng)家 Nanopre

4、測序方法

4.1上機操作

1)用測序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix

2)用測序輔助擴展試劑盒配置上機文庫

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測序儀運行MinKnow 軟件，開(kāi)始測序，默認運行72 小時(shí)

4.2測序設備

PromethION48 測序儀 廠(chǎng)家 Nanopore 儀器規格 PromethION48

4.3測序試劑

測序芯片制備試劑盒 廠(chǎng)家 Nanopore 貨號 EXP-FLP004

測序輔助擴展試劑盒 廠(chǎng)家 Naonopore 貨號 EXP-AUX003

測序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 廠(chǎng)家 Nanopore 貨號 FLO-PRO114M