空間轉錄組測序技術(shù)識別蘭花早期發(fā)育的多種細胞類(lèi)型并揭示其發(fā)育過(guò)程。

近日，Nucleic acids research（IF=19.160）在線(xiàn)發(fā)表了由復旦大學(xué)戚繼研究員團隊和江西農業(yè)大學(xué)國春策教授團隊合作完成的研究論文“A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers”。本研究應用10x Visium空間轉錄組技術(shù)對蘭科植物蝴蝶蘭（Phalaenopsis?Big Chili）的花器官的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了研究。通過(guò)分析數千個(gè)與花發(fā)育相關(guān)基因的空間表達分布，高分辨率地識別了蘭花早期發(fā)育的多種細胞類(lèi)型。百邁客有幸參與此項研究工作，為該研究提供了空間轉錄組測序服務(wù)。接下來(lái)，我們一起來(lái)看一下這篇文章講了一個(gè)怎樣的精彩故事。

研究背景

花器官的發(fā)育是被子植物中特有的一個(gè)神秘過(guò)程，涉及到細胞在特定位點(diǎn)的生長(cháng)、分裂和分化以及細胞與細胞之間的相互作用等一系列細胞活動(dòng)。典型的高等植物花器官一般可以分為四輪結構,從外向內依次是萼片、花瓣、雄蕊和心皮。而控制花的四輪結構發(fā)育的就是典型的“ABC”模型，MADS-box基因在其中起著(zhù)非常重要的作用。

蘭科是被子植物中較大的科之一，有763屬，28,000多個(gè)種，被認為是研究花器官發(fā)育和進(jìn)化的模式科。然而，對蘭花花發(fā)育復雜過(guò)程的全面認識還遠遠不夠，特別是缺乏對其器官發(fā)生關(guān)鍵調控網(wǎng)絡(luò )的時(shí)空研究。

研究思路

研究結果

1、蘭花花器官早期發(fā)育的空間轉錄組測序和細胞類(lèi)型識別

為了提供花器官發(fā)生的時(shí)空細胞圖譜，以便全面理解器官發(fā)生的復雜過(guò)程，本研究在10×?Visium平臺上對蝴蝶蘭(P. Big Chili)三個(gè)總狀花序組織樣本的矢狀面進(jìn)行了空間轉錄組測序，從時(shí)期上覆蓋了花序分生組織存在到接近成熟的花器官的大部分早期發(fā)育階段（圖1A）。研究團隊利用自主開(kāi)發(fā)的STEEL算法，將空間轉錄組數據清晰地分為40個(gè)clusters（圖1B、C）。其中，花被片、唇瓣和花柱組織中的beads聚類(lèi)性較好，且與相應的組織形態(tài)學(xué)檢測的觀(guān)察結果高度一致。 總之，三張切片的空間轉錄組共檢測到14,328個(gè)基因的表達，其中有3,817個(gè)基因被鑒定為特異性或優(yōu)先在一個(gè)或多個(gè)組織中表達，為后續詳細分析從分生組織細胞到分化后細胞的細胞類(lèi)型變化提供了分子圖譜。

圖1?基于空間轉錄組學(xué)的蘭花早期發(fā)育階段器官發(fā)生的重建

2.早期花原基存在分生組織細胞，隨后分化為營(yíng)養型細胞和生殖細胞

為了研究從分生組織細胞到營(yíng)養型細胞(花被、唇瓣)和生殖細胞(花柱)的分化，研究團隊用Monocle繪制了細胞狀態(tài)的軌跡。如圖2B所示，三簇分生組織細胞形成了一條連續的路徑，代表其發(fā)育過(guò)程，與其在組織學(xué)切片上的位置高度一致。該路徑分為兩條子路徑：一條是由花被片中的營(yíng)養型細胞組成，另一條由花柱中的花藥原基生殖細胞組成。細胞類(lèi)型變化的軌跡作為動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程的靜態(tài)投影，也可以理解為分生組織細胞的擬時(shí)序分化。如圖2C所示，此時(shí)營(yíng)養型細胞出現較早，并分散在子路徑的遠端。共鑒定出4,685個(gè)空間差異基因與發(fā)育擬時(shí)間相關(guān)，對這些基因繪制分支軌跡基因表達熱圖，發(fā)現它們隨著(zhù)發(fā)育路徑的分離表現出不同的表達模式（圖2D）。MapMan功能富集圖顯示它們主要富集在細胞壁代謝、激素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA合成等功能上（圖2E）。通過(guò)基因的擬時(shí)分布圖發(fā)現許多其他基因可能在分生組織、營(yíng)養組織和生殖組織的細胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用(圖2F)。

圖2?分生組織細胞向營(yíng)養型細胞和生殖細胞的分化

3.MADS-box基因的空間表達分布說(shuō)明了決定蘭花花部器官的ABC code

為了發(fā)現蘭花中特異的ABC code，本研究對7種被子植物的MADS-box基因進(jìn)行了系統發(fā)育分析。在蝴蝶蘭中的21個(gè)ABCDEG類(lèi)MADS-box基因中，有15個(gè)基因在空間轉錄組數據集上檢測到表達信號，且在不同組織部位呈現出優(yōu)先或特異的表達模式（圖3）。其中，AP3-like和PI-like基因(B類(lèi)基因)均在花被片、唇瓣和花柱的原基中表達。特別是PAXXG070630在花柱頂端組織周?chē)憩F出梯度表達信號，其中單個(gè)spot點(diǎn)表達量高，其周?chē)毎谋磉_信號隨著(zhù)離中心spot點(diǎn)的距離增大而減弱，表明花藥在發(fā)育的這一階段是從單個(gè)spot點(diǎn)開(kāi)始的。AG-like（C類(lèi)基因）的空間表達譜上也存在類(lèi)似的情況，為花藥的器官發(fā)生提供了進(jìn)一步的證據。而AP1-like基因（A類(lèi)基因）優(yōu)先表達于分生組織中或廣泛表達于各器官中，AGL6-like（G類(lèi)基因）則在唇瓣和花被片中特異表達。

4.持續激活的分生組織細胞群參與花被片的形成

通過(guò)對被片細胞進(jìn)行發(fā)育軌跡分析，發(fā)現5號花苞被片細胞處于發(fā)育軌跡*遠端，基因表達呈現出高度一致性。而6號花苞被片細胞由4個(gè)亞群組成,顯示出細胞之間的高度異質(zhì)性。如圖4A所示，發(fā)育軌跡分析顯示，發(fā)育起始于基部分生組織細胞（cluster22、cluster27），然后路徑分散為在近期分化(cluster1)和早期分化(cluster2)的被片細胞。擬時(shí)序分析表明細胞狀態(tài)從分生組織到近期分化細胞再到早期分化細胞的持續變化(圖4B、C)。通過(guò)對6號花苞分生組織細胞群和分化早期、近期的被片細胞群中檢測到的987個(gè)基因，繪制分支軌跡基因表達熱圖，發(fā)現它們的表達水平與組織部位呈現高度相關(guān)性（圖4D）。分生組織、被片組織優(yōu)先表達的基因顯著(zhù)富集在蛋白質(zhì)合成、光合作用和細胞壁合成等相關(guān)途徑上（圖4E）。

圖4?切片1中6號花苞的分生組織細胞向花被片細胞分化的分析

5.花藥發(fā)育的起始和隨后多種細胞類(lèi)型的分化

與花被、唇瓣這類(lèi)營(yíng)養組織不同，花藥的發(fā)育起始時(shí)間更晚，過(guò)程也更為復雜?；ㄋ幤鹗加诨ㄖ敹说幕ㄋ幵?，如圖2A所示，spot點(diǎn)中B-和C-功能基因表達呈現高表達。與此同時(shí)，許多下游基因被激活，用于進(jìn)一步的形態(tài)建成過(guò)程。例如，在6號花苞的花藥中心出現花粉塊，之后在7號和8號花苞中可以觀(guān)察到它的形狀變化過(guò)程（圖5A）。為了進(jìn)一步探究花藥發(fā)育過(guò)程中基因表達的動(dòng)態(tài)變化，收集了花藥原基或花粉上優(yōu)先表達的1,683個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現不同花苞之間存在不同的表達模式。正如如圖5B所示，在5號花苞和8號花苞中分別有123和141個(gè)基因高表達。而其中大部分基因呈現從5號花苞到8號花苞整體減少的表達模式。展示了與蘭花生殖相關(guān)營(yíng)養型細胞中特異表達或優(yōu)先表達的一系列關(guān)鍵基因，顯示了花藥發(fā)育過(guò)程中表達譜的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對三個(gè)樣本的120個(gè)clusters進(jìn)行PCA分析，表明花藥的早期營(yíng)養組織，雖然存在相似的基因表達模式，沒(méi)有表現出特異表達的基因，但在發(fā)育后期迅速經(jīng)歷了分化和形態(tài)建成過(guò)程（圖5C）。

圖5?花藥多發(fā)育階段的身份決定與形態(tài)建成

總? 結

本研究利用10x Visium空間轉錄組學(xué)數據分析了蝴蝶蘭花器官早期發(fā)育過(guò)程中基因表達的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對時(shí)空表達分布的比較，確定了在特定組織/階段優(yōu)先表達的數千個(gè)基因，包括MADS-box基因和許多其他潛在下游基因，形成了花器官初始化、身份決定和形態(tài)建成的模型。對蘭花開(kāi)花發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了系統的研究，為進(jìn)一步研究蘭花開(kāi)花過(guò)程中復雜而重要的基因調控網(wǎng)絡(luò )提供了寶貴的資源。

百邁客空間轉錄組測序項目經(jīng)驗

百邁客空間轉錄組已在近百種物種上積累大量經(jīng)驗，建立了成熟的植物組織透化體系，主要包括莖、芽、花、根、種子等組織類(lèi)型，部分項目經(jīng)驗詳情展示如下：

除了10x空間轉錄組項目經(jīng)驗和植物切片結果外，百邁客還有百創(chuàng )S1000空間轉錄組的實(shí)測高清結果圖片供欣賞百創(chuàng )S1000的優(yōu)勢有：

• 亞細胞級分辨率
• 多級分辨率動(dòng)態(tài)分析
• 1-8樣本，靈活上樣
• 兼容HE/甲苯胺藍染色，保留組織原始形態(tài)

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參考文獻

Liu C, Leng J, Li Y, Ge T, Li J, Chen Y, Guo C, Qi J. A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers. Nucleic Acids Res. 2022 Sep 12:gkac773.