Natl Sci Rev：柑橘無(wú)融合生殖演化研究

2022年6月，華中農業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室鄧秀新院士團隊在National Science Review上發(fā)表了題為“Structural variation and parallel evolution of apomixis in citrus during domestication and diversification”的研究論文，首次揭示了柑橘中不同屬間無(wú)融合生殖性狀存在平行進(jìn)化，回答了現代栽培柑橘廣泛存在無(wú)融合生殖的遺傳機制，對柑橘育種研究具有重要啟示。百邁客有幸參與本項研究，完成其中PacBio、Hi-C測序等工作。

研究背景

我國是柑橘的起源地之一，栽培品種類(lèi)型繁多，柑、橘、橙、柚、葡萄柚、檸檬、金柑、雜柑等都有規?；脑耘?。柑橘廣泛存在無(wú)融合生殖的特性，導致后代基因型和母本保持一致，阻礙了柑橘的雜交育種進(jìn)程。因此，研究柑橘無(wú)融合生殖對于加速柑橘遺傳改良具有重要意義。此外，無(wú)融合生殖還被運用于作物的雜種優(yōu)勢固定，具有重要應用前景，對我國種業(yè)發(fā)展具有重要意義。柑橘是研究孢子體無(wú)融合生殖的模式材料，解析柑橘無(wú)融合生殖的遺傳機制，能夠為作物雜種優(yōu)勢固定提供新的思路。

柑橘中的金柑屬在我國具有悠久的栽培歷史，山金柑 (Hongkong kumquat,?Fortunella hindsii) 是金柑屬的一種常綠野生果樹(shù)，具有無(wú)融合生殖和有性生殖兩種類(lèi)型，是研究無(wú)融合生殖的良好材料。

主要研究結果

柑橘基因組組裝與結構變異

為了解析柑橘珠心胚的進(jìn)化、遺傳和分子機制，作者對山金柑自交系Sy3-45進(jìn)行了基因組組裝。最終完成了323.72 Mb（contigN50=9.77?Mb）的高質(zhì)量基因組（圖1a），其連續性比之前的版本提高了4.4倍。BUSCO評估（97%）、共線(xiàn)性評估，均顯示本次構建了高質(zhì)量的柑橘基因組。通過(guò)對不同起源、不同生殖模式柑橘的半合子基因數量進(jìn)行評估，發(fā)現半合子基因數量與生殖模式有關(guān)，克隆和無(wú)融合生殖作物的半合子基因數量最高，而自交作物的半合子基因數量較低。

柑橘無(wú)融合生殖表型的多起源

收集了234份柑橘亞族的材料全基因組測序數據（其中46份是該研究新測的山金柑種質(zhì)），這些數據中包括介于雜交起源的混合類(lèi)群（即葡萄柚、甜橙、檸檬和酸橙）。系統發(fā)育分析表明，生殖模式在多種情況下從完全有性生殖向無(wú)融合生殖和再回到有性生殖（圖2）。無(wú)融合生殖表型在柑橘中廣泛分布，研究表明無(wú)融合生殖可能在該類(lèi)群中有多個(gè)起源。對群體結構分析區分的12個(gè)類(lèi)群進(jìn)行全基因組的基因深入分析，發(fā)現基因滲入在全基因組廣泛存在。但聚焦到無(wú)融合生殖區段后發(fā)現，漸滲并不能解釋柑橘屬和金柑屬無(wú)融合生殖的發(fā)生。

無(wú)融合生殖和有性生殖群體的結構和有害負擔

柑橘通過(guò)珠心進(jìn)行無(wú)融合生殖，保留了母體基因型，這可能導致基因組中有害突變和結構變異（SVs）的積累。從234份材料中共鑒定出139,241個(gè)可靠的SVs，其中64.2%為缺失，16.6%為重復，15.5%為易位。山金柑的SV數量最高，可能與有效種群大小減少有關(guān)（圖3a）。具有無(wú)融合生殖的雜交群體的雜合有害變異約為有性生殖群體的1.45倍。隨后提出了雜種無(wú)融合生殖將SVs隱藏在雜合子狀態(tài)的假說(shuō)，這可能主要是隱性選擇造成的危害。因此，有性生殖的雜種可能會(huì )迅速以隱性純合的方式暴露有害變異。這個(gè)假說(shuō)解釋了為什么無(wú)融合生殖和有性生殖的天然雜交樣本中觀(guān)察到的自然雜種通常是無(wú)融合生殖的。有害突變的模式與SVs的模式一致，即與有性生殖群體相比，無(wú)融合生殖群體的隱性有害負擔較低（7.39%），雜合子SVs較多（約2.62倍）。在隱性模型下，從無(wú)融合生殖到有性生殖的生殖模式轉變導致種群適應度在轉變后立即下降13.48±0.87%，但隨后恢復（圖3i）。相比之下，保持無(wú)融合生殖的種群保持種群適合度。

同一位點(diǎn)有助于金柑屬和柑橘屬的無(wú)融合生殖

山金柑具有無(wú)融合生殖和有性生殖兩種類(lèi)型，為了定位山金柑無(wú)融合生殖的潛在位點(diǎn)，作者利用無(wú)融合生殖的山金柑系“DB”與兩個(gè)有性生殖的山金柑“PN”和“PN03”作為母本雜交構建了一個(gè)分離群體（圖4a）。通過(guò)ΔSNP指數及KASP標記等方式進(jìn)一步將相關(guān)位點(diǎn)縮小到chr4上313 Kb區域?；?13 Kb區域的系統發(fā)育學(xué)及全基因組fb統計表明，至少有一些山金柑的無(wú)融合生殖是通過(guò)基因滲入產(chǎn)生的。進(jìn)行序列比對以進(jìn)一步確定與山金柑（313 Kb）、柑橘（380 Kb）和柚子（80 Kb）基因組共享的無(wú)融合生殖基因組區域中珠心胚發(fā)生和發(fā)育相關(guān)的主要原因（圖5a）。這三個(gè)區域之間的最小重疊包含FhRWP基因，這是一種RWP-RK域轉錄因子，與據報道與有助于柑橘無(wú)融合生殖的CitRWP基因同源。

柑橘亞族無(wú)融合生殖的雜合MITE插入

為了研究柑橘無(wú)融合生殖決定區的遺傳變異模式，基于單倍型構建了313 Kb區域的系統發(fā)育樹(shù)（圖5b）。結果表明，柑橘存在多種無(wú)融合生殖現象。同一個(gè)體的兩個(gè)單倍型并不總是聚集在同一分支中，這表明不同群體中無(wú)融合生殖的起源不同。前期研究表明，在CitRWP基因啟動(dòng)子中插入的MITE與無(wú)融合生殖相關(guān)。作者將PCR和循環(huán)一致性測序（CCS）相結合，以闡明FhRWP啟動(dòng)子的復雜結構。結果證實(shí)，MITE的插入與無(wú)融合生殖和無(wú)融合生殖單倍型密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，不同數量的MITE及其不同的序列表明無(wú)融合生殖等位基因可能起源不同；MITE插入在雜合子狀態(tài)下非常常見(jiàn)，這可能與無(wú)融合生殖品種的單倍型差異有關(guān)。

與FhRWP中MITE相互作用的因素

通過(guò)細胞學(xué)分析珠心胚的起始過(guò)程，無(wú)融合生殖山金柑的胚珠在開(kāi)花時(shí)明顯，但在有性生殖山金柑中不明顯（圖6a）。轉錄組分析表明，在開(kāi)花前7天和開(kāi)花后7天兩個(gè)時(shí)期，有MITE插入的無(wú)融合生殖單倍型中均檢測到FhRWP表達，但在無(wú)MITE插入的有性生殖材料中未檢測到表達（圖6b）。在開(kāi)花后0、3、5、10和20天的五個(gè)發(fā)育階段的RT-qPCR檢測證實(shí)了這一結果。

甲基化及酵母單雜分析進(jìn)一步的探索了FhRWP基因表達調控的相關(guān)因素，鑒定了一種轉錄因子FhARID（Fh3g37720），位于與無(wú)融合生殖區不同的染色體上，該轉錄因子編碼一個(gè)富含AT的相互作用域的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)結合到FhpMITE右側片段（圖6h）。FhARID在無(wú)融合生殖的山金柑胚珠中特異表達。為了研究MITE類(lèi)序列的數量是否對FhARID誘導的FhRWP表達激活很重要，作者構建了具有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)pMITE序列拷貝的啟動(dòng)子，并通過(guò)瞬時(shí)轉化煙草進(jìn)行了雙熒光素酶測定。結果表明，FhARID結合pMITE序列并激活連鎖報告基因表達，但pMITE序列的數量在FhARID介導的激活中沒(méi)有顯示出顯著(zhù)差異。

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研究小結

該研究團隊利用山金柑品系Sy3-45為材料進(jìn)行了高質(zhì)量染色體級別基因組的組裝和遺傳群體構建，實(shí)現了金柑屬無(wú)融合生殖關(guān)鍵基因的定位。結合柑橘不同屬材料的全基因組重測序數據，進(jìn)一步解析了金柑屬和柑橘屬無(wú)融合生殖表型的平行進(jìn)化機制。該研究發(fā)現，雜交起源的柑橘群體能夠通過(guò)無(wú)融合生殖來(lái)保持雜交優(yōu)勢，并導致無(wú)融合生殖的關(guān)鍵MITE插入以雜合子形式存在，首次提出了無(wú)融合生殖在柑橘分化和馴化過(guò)程中的重要作用。

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